多次貼壁法高效制備人臍帶間充質干細胞

何潔，趙晶，王金祥，蔡學敏，龐榮清，潘興華

多次貼壁法高效制備人臍帶間充質干細胞

何潔，趙晶，王金祥，蔡學敏，龐榮清，潘興華

目的建立一套簡單、高效、穩定、規范的人臍帶間充質干細胞體外制備與鑒定技術，為人臍帶間充質干細胞庫建設及臨床應用提供技術規范。方法改進前期技術方法，重復驗證，建立規范化技術方法。無菌采集足月剖宮產分娩胎兒臍帶，采用不剝離血管和包膜組織貼壁法培養臍帶間充質干細胞。待原代細胞長出時，收集原本換液應丟棄的組織塊，進行二次貼壁培養，如此反復，待二次貼壁組織塊長出細胞時，收集組織塊進行三次貼壁培養。對三次貼壁培養長出的第三代細胞進行生物學特性分析。結果首次組織貼壁后10～12 d可見成纖維樣細胞從組織塊爬出，二次、三次貼壁后第2 d就可見成纖維細胞樣細胞爬出，且生長狀況好，細胞形態更為均一。三次貼壁培養的第三代細胞都高表達CD29、CD44、CD90和CD105，不表達CD34和CD45。細胞生長曲線呈“S”型，均具有成脂、成骨、成軟骨分化的能力。結論采用多次貼壁法制備的人臍帶間充質干細胞充分利用了臍帶組織塊，且得到的原代細胞數量翻倍，其生物學特性穩定。

臍帶間充質干細胞；分離；貼壁培養

臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)可廣泛用于各種損傷和退變性疾病治療，因其具有材料來源豐富、適于標準化制備、臨床應用免疫原性低等特點，將成為未來干細胞臨床應用的理想選擇。Mitchell等[1]首次從臍帶華通膠中分離出成纖維樣細胞，并且證實具有多向分化潛能后，人們采用組織塊法、酶消化法和兩者結合的酶組織法均分離得到UC-MSC，并且已證明在體外能分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞等多種細胞[2-3]。通過比較后分析，3種方法各有利弊。涉及UC-MSC的臨床應用，必須建立簡單、高效、穩定、規范的原代UC-MSC制備與鑒定技術，獲得足夠數量并符合臨床要求的標準化UC-MSC，才能保證臨床應用的安全性和有效性。本研究通過對前期建立的UC-MSC制備技術進行改進和重復實驗，建立了組織塊二次、三次貼壁培養法，充分利用了臍帶組織塊，大大提高了原代細胞的產量，縮短了培養時間，為臨床研究和應用提供了充足的標準化種子細胞和技術。

1 材料與方法

1.1 材料來源在征得產婦和家屬知情同意的情況下，在本院婦產科產房取健康足月剖腹生產的新生兒臍帶。產婦無傳染性疾病、遺傳病史，胎兒無先天性疾病。

1.2 主要試劑和設備DMEM/F12培養液為Hyclone公司產品，胎牛血清（FBS）和0.25%trypsin-EDTA均為BI公司產品；MTS檢測試劑盒為Promega公司生產；流式單抗CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC和CD105-PE均為Beckman公司生產；成脂、成骨、成軟骨分化誘導試劑盒均是GIBCO公司產品；流式細胞儀為Beckman公司生產。

1.3 UC-MSC的分離培養在無菌條件下，將采集的臍帶用含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的PBS液反復沖洗，去掉殘留的血液。然后將臍帶分解為1 mm3的組織塊，轉移至培養瓶中，加入少許含有10%FBS的DMEM/F12使其均勻分布，于5%CO2、37℃的培養箱中靜置培養。5 d后初次換液，而后3~4 d換液，觀察組織貼壁生長狀況。待細胞從組織塊爬出且生長至80%~90%融合狀態時，用0.25%trypsin-EDTA消化傳代，并將洗脫下來的組織塊繼續接種新的培養瓶培養；待第二次組織塊貼壁爬出的細胞生長至80%~90%融合狀態時，用0.25%trypsin-EDTA消化傳代，并將第二次組織貼壁培養后洗脫下來的組織塊繼續接種新的培養瓶培養，進行第三次組織貼壁培養。對三次組織塊貼壁培養出的細胞進行生物學特性鑒定。

1.4 增殖能力檢測取三次貼壁培養后各自的第三代細胞(P3)，按照2×103/孔接種96孔板，100μl/孔，置于5%CO2、37℃的培養箱中靜置培養。每隔24 h，每孔加入20μl MTS孵育2 h后，用酶標儀（490 nm）測定各孔吸光度值，連續觀察10 d后，以時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制生長曲線。

1.5 免疫表型檢測消化收集三次貼壁培養的P3代細胞，生理鹽水洗滌3次，分成每管含1×106個細胞，分別加入CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC5、CD90-FITC、CD105-PE和同型對照10μl，4℃避光孵育30min，磷酸鹽緩沖液洗滌棄除未結合抗體后，上流式細胞儀檢測表面抗原標志的表達水平。

1.6 分化潛能檢測成脂誘導分化：消化收集三次貼壁培養的P3代細胞，按照1×104個/cm2接種到12孔板中靜置培養，至細胞100%甚至是過度融合時，丟棄10%FBS的DMEM/F12培養液，加入成脂分化誘導液培養，每隔3 d換液。培養14 d后，4%多聚甲醛固定后加入油紅O染色。

成骨分化：將P3代細胞按照5×103/cm2接種到12孔板中靜置培養，至細胞60%融合狀態時，丟棄培養液，加入成骨誘導液連續培養，每隔3 d換液。培養21 d后，4%多聚甲醛固定后加入茜素紅染色。

成軟骨分化：收集P3代細胞，調整密度為1× 107/ml，取5μl接種至12孔板中，置于5%CO2、37℃的培養箱中靜置培養2 h后，緩慢加入預熱好的成軟骨分化培養液靜置培養，每隔3 d換液。培養14 d后，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋軟骨細胞小球、病理切片，脫蠟后加入阿新藍染色，生物顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 UC-MSC的分離培養不剝離血管和包膜組織貼壁法培養，最早7 d后就可以在倒置相差顯微鏡下觀察到有細胞從邊緣爬出，呈細小梭形（圖1A），12 d可見大量細胞呈克隆狀生長（圖1B）。將洗脫下的組織塊進行第二次、第三次貼壁時，第2 d就可以看見細胞爬出（圖1C），5 d就可見克隆樣生長（圖1D），其產量為以前的3倍，且傳代后生長速度快、活性好，大量的成纖維細胞樣細胞呈旋渦狀生長（圖1E）。

圖1 臍帶組織塊貼壁法培養UC-MSC的形態觀察(×10)

2.2 UC-MSC的增殖能力細胞剛接種前2 d處于滯留期，增殖不明顯；3~7 d進入對數增殖期，細胞生長旺盛，活力最佳；第8 d進入平臺期。三次貼壁后培養的UC-MSC生長曲線均呈典型的“S”型，無明顯差異。

2.3 UC-MSC的免疫表型對三次貼壁培養的P3代細胞進行流式檢測，結果均顯示：低表達或不表達CD34、CD45，高表達CD29、CD44、CD90，而CD105的表達隨著再次貼壁培養而升高（表1），說明第二、三次貼壁培養的細胞也是UC-MSC，且純度更高。

表1 貼壁培養的P3代細胞UC -MSC流式檢測結果(%）

2.4 UC-MSC的分化潛能成脂分化：三次貼壁培養的細胞成脂分化誘導14~21 d后，經油紅O染色，胞漿內可見紅色脂滴（圖2）；成骨分化：誘導14~21 d后，鈣質結節可被茜素紅染成紅色（圖3）；成軟骨分化：誘導14~28 d后，石蠟包埋切片，可見軟骨膠原基質被阿甲新藍染成藍色（圖4）。三次貼壁培養的細胞均有向脂肪、骨和軟骨分化的潛能。

圖2 UC-MSC成脂分化

圖3 UC-MSC成骨分化

圖4 UC-MSC成軟骨分化

3 討論

已經證實，間充質干細胞應用于治療脊髓損傷、腦缺血、多發性硬化癥等涉及創傷、缺血、中毒、退變誘導的組織細胞變性、壞死、缺失等疾病均有一定治療意義[4-5]。因臍帶為胎兒分娩時的廢棄物，比起骨髓來源的間充質干細胞取材更為方便，不容易受到供體年齡的限制[6]而受到廣泛的關注。

通常對于臍帶原代組織的培養方法主要有酶消化法、組織貼壁法以及兩者結合的酶組織法。酶消化法成本高，消化時間難于控制，消化液黏稠而不易分離，而且膠原酶對細胞有直接損傷作用。傳統的組織貼壁法較為簡單，成本低，但是細胞爬出時間過長，通常需要10 d左右，兩者結合的酶組織法為貼壁培養酶消化后的組織塊，方法雖也簡易，細胞易于爬出，但是操作步驟比較繁瑣，細胞接觸東西比較多，容易污染。基于3種分離培養方法的基礎上，龐榮清等[7]用一種不剝離血管和包膜直接剪碎貼壁培養的方法，也培養出活性好且穩定的臍帶間充質干細胞，此法更為簡易可行。本研究在此基礎上進行改良，用已爬出細胞時本應丟棄的組織塊進行二、三次貼壁，充分利用組織塊，不造成浪費，且經過第一次貼壁后組織塊中的華通膠更為暴露易于培養，接種的第2 d就能看見細胞爬出，第5 d就有大片的克隆樣生長，產量為之前的3倍，提高了利用率的同時，也提高了原代細胞的產出效率。與第一次貼壁培養的細胞相比，第二、三次貼壁培養的細胞免疫表型分析結果顯示，與間充質干細胞比較相關的表面標記CD90、CD105表達稍微增高，說明經過第一次貼壁培養后，淘汰了雜細胞，后面再次貼壁養出的細胞純度更高。

本研究還對比了三次貼壁培養后的生長曲線，群體倍增時間以及多向分化潛能，結果顯示生長曲線形態相似，都具有向骨、軟骨和脂肪分化的能力，根據間充質干細胞的鑒定標準[8]，可以判定這些貼壁生長的細胞就是臍帶間充質干細胞。

總之，本研究采用反復貼壁培養的方法，建立了相對規范的UC-MSC制備與鑒定技術方法，不僅操作簡單，而且得到的原代細胞數量翻倍，縮短了臍帶離體后到接種的時間，大大保持了其活性，避免了過多的與外來物質的接觸，降低了變異的幾率，值得廣泛應用。

[1]Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia[J].Stem Cells,2003,1: 50-60.

[2]Kang XQ,Zang WJ,Song TS,et al.Rat bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into hepatocytes in vitro[J]. World JGastroenterol,2005,11(22):3479-3484.

[3]Sanchez-Ramos JR.Neural cells derived from adult bonemarrow and umbilical cord blood[J].JNeurosciRes,2002,69(6):880-893.

[4]Herzog EL,Chai L,Krause DS.Plasticity ofmarrow-derived stem cells[J].Blood,2003,102(10):3483-3493.

[5]Deans RJ,Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biology and potential clinical uses[J].Exp Hematol,2000,28(8):875-884.

[6]Wang L,Tran I,Seshareddy K,et al.A comparison of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for cartilage tissue engineering[J].Tissue Eng Part A,2009,15(8):2259-2266.

[7]龐榮清,何潔,李福兵,等.一種簡單的人臍帶間充質干細胞分離培養方法[J].中華細胞與干細胞雜志,2011,1:30-33.

[8]Jones BJ,McTaggart SJ.Immunosuppression by mesenchymal stromal cells:from culture to clinic[J].Exp Hematol,2008,36(6): 733-741.

Efficient preparation of human umbilical cordmesenchymal stem cells bymultiple adherencemethod

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Clinical College of Kunming General Hospital,Kunming Medical University/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To establish a simple,efficient,stable,and standardized human umbilical cord mesenchymal stem cell preparation and identification technology in vitro,and to provide technological specification for the establishment and clinical application of human umbilical cord mesenchymal stem cell bank.Methods The technique and method in the early time were improved and repeatedly verified.A standardized technicalmethod was established.The umbilical cords of fetuses taking cesarean delivery at full term were aseptically collected.The umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured by the method of not stripping the vessel and coated vascular tissue adherentmethod.When the primary cells grew,the tissue blocks which should be discarded at firstwere collected and adherently cultured for the second time.Repeatedly like that,the tissue blockswere collected for the third time adherent culture until the cells grew out in the blocks cultured at the second time.The cells of the third generation cultured during the three times of adherent culture were analyzed for the biological characteristics.Results Fibroblast-like cells could be seen climbing out 10-12 d after the first time adherence and on the third day after the second and third time of adherence.The growing condition was good,and the cell shape wasmore uniform.CD29,CD44,CD90,and CD105 were all highly expressed in the cells of the third generation cultured during the three times of adherent culture.However,CD34 and CD45 were not expressed.The cell growth curve was S type,and the cells could be induced to differentiate into adipocytes,osteogenesis,and chondrocytes.Conclusion The preparation of human umbilical cord mesenchymal stem cells by the method of multiple adherence method fully takes advantage of the umbilical cord tissue blocks and gets the number of primary cells doubled,and its biological characteristics is stable.

umbilical cordmesenchymal stem cell;isolation;adherent culture

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0828-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.006

2015-03-26）

國家科技支撐計劃（2014BI01B0）;云南省戰略性新興產業專項（2013DA004）;云南省科技創新平臺建設項目（2013DA004）

650032昆明,成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫學研究重點實驗室

龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com；潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com