綿羊乳突類圓線蟲病的診斷及蟲種鑒定

范國英 王順崗 陳桂香

摘要：對河南省新鄉市某羊場疑似乳突類圓線蟲病的綿羊進行了臨床檢查，取其糞便采用飽和鹽水漂浮法檢查，斯陶爾氏蟲卵計數法計數，幼蟲進行培養與鑒定等。結果表明，病羊糞便中有大量疑似乳突類圓線蟲蟲卵，對蟲卵培養后，根據幼蟲大小、蟲體形態學觀察確診為綿羊乳突類圓線蟲病。

關鍵詞：綿羊；乳突類圓線蟲??；診斷；幼蟲培養；蟲種鑒定

中圖分類號：S852.73+1；S858.26 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2442-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.036

羊乳突類圓線蟲病是由類圓線蟲屬（Strongyloides stercoralis）中的乳突類圓線蟲（Strongyloides papillosus）所引起牛、羊等反芻動物的一種寄生蟲病。患該病的羊常常消瘦、貧血、嘔吐、腹瀉，最后多因極度衰弱而死亡，死亡率可達50%[1]。乳突類圓線蟲只有孤雌生殖的雌蟲，目前未見有雄蟲寄生的報道。雌蟲身體細小，乳白色，口腔小，有兩片唇，食道簡單，陰門位于體后1/3與中1/3交界處，有兩片突出的小唇。孤雌生殖的雌蟲在終末宿主小腸產含有第一期幼蟲的蟲卵，并排到外界。在外界從蟲卵孵出第一期幼蟲。對該病的預防措施主要是在每年春秋兩季用丙硫咪唑驅蟲1～2 次。本研究對河南省新鄉市某羊場疑似乳突類圓線蟲病的綿羊進行了臨床檢查，糞便采用飽和鹽水漂浮法檢查，斯陶爾氏蟲卵計數法計數，幼蟲進行培養與鑒定等，最終確診該羊場羊只所患疾病為綿羊乳突類圓線蟲病。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 食鹽、碘化鉀、碘等均為市售。各種溶液的配制，飽和鹽水、盧戈氏碘液配制方法參見文獻[2]。

無菌糞汁：取適量羊的新鮮糞便加入適量蒸餾水，攪拌使其混合均勻，然后用紗布濾去粗大的糞渣，濾液在火爐上煮沸2 h滅菌和殺蟲[3]。

1.1.2 試驗器材 SPX-150B智能型系列生化培養箱，上海將來實驗設備有限公司；WF10/18型顯微鏡，上海兆儀光電科技有限公司。260目錦綸篩兜等均為市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床檢查 采用病史調查、臨床基本檢查法等進行臨床檢查。

1.2.2 糞便的采集和厭氧保存 糞便采自河南省新鄉市某羊場的疑似乳突類圓線蟲病的綿羊。在100 mL的塑料杯中放入10粒左右直徑8 mm的玻璃珠，加入約85 mL的自來水。加入10 g新鮮糞便，擰緊瓶蓋，用力搖動1 min，使糞球破碎，瓶內糞便很快變為無氧狀態[3]。將瓶在20 ℃左右保存，7 d后可收集蟲卵用于試驗。

1.2.3 飽和鹽水漂浮法 取糞便10 g，加飽和鹽水100 mL，混勻，通過60目銅篩，濾入燒杯中，靜置0.5 h，蟲卵上浮，用一直徑5～10 mm的鐵絲圈，與液面平行接觸以沾取表面液膜，抖落于載玻片上加蓋玻片進行觀察，并測量其大小。同法制得載玻片上蟲卵經盧戈氏碘液染色后加蓋玻片顯微鏡下觀察。

1.2.4 斯陶爾氏蟲卵計數法（Stolls method） 在一小玻璃容器上（如小三角燒瓶或大試管），在容量56 mL和60 mL處各做一個標記，先取0.4%的NaOH溶液注入容器內至56 mL處，再加入被檢糞便使液體升到60 mL處，而后加入一些玻璃珠，振蕩使糞便完全破碎混勻，而后以1 mL的吸管吸取液體0.15 mL，滴于2～3張載玻片上，覆以蓋玻片，在顯微鏡下循序檢查，統計其中蟲卵總數（注意不可遺漏和重復）。因0.15 mL糞液中實際含原糞量是0.01 g，因此所得蟲卵總數乘以100即為每克糞便中的蟲卵數[4]。

1.2.5 幼蟲培養與蟲種鑒定

1）綿綸篩兜集卵法：參見文獻[4]。此法適用于長度大于60 μm的蟲卵，通過處理，粗大糞渣被銅篩扣留，纖細糞渣（直徑小于40 μm）和可溶性色素均被沖洗走而使蟲卵集中，本試驗收集濾液。

2）無菌糞汁法培養：將收集到的蟲卵液搖勻后，吸取2 mL于培養皿內，再吸取無菌糞汁0.2～0.5 mL于培養皿內，混勻后貼上標簽28 ℃培養箱中培養。

3）羊糞堆丘法培養：按Henriksen[5]、王慶良[6]的方法改良。將新鮮羊糞碾碎并加入適量鋸末，攪勻加入自來水保持其濕潤，在培養皿上放一張濾紙，將糞便裝填成錐形，即糞便樣品中間部分稍高于平皿水平面1～2 mm，四周低于平皿水平面10～15 mm，28 ℃培養箱中進行培養。

4）蟲種鑒定：蟲卵及幼蟲經盧戈氏碘液染色后加蓋玻片，顯微鏡下通過觀察其形態、大小等進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 臨床檢查結果

臨床可見病羊有不同程度的貧血、消瘦、腹瀉癥狀，感染性幼蟲穿過皮膚移行到肺時，常引起濕疹、支氣管炎、肺炎和胸膜炎，最后多因極度衰弱而死亡，死亡率可達50%；少量寄生時，臨床癥狀不明顯，但影響生長發育。絲蟲蚴侵入成年羊體內時常不能發育至性成熟，但病羊及年老體弱羊有時感染。

2.2 飽和鹽水漂浮法檢查結果

2.2.1 蟲卵形態 蟲卵形態見圖1、圖2。顯微鏡下觀察到大量蟲卵，蟲卵為橢圓形，殼薄，無色透明，蟲卵大小為（42～60） μm ×（25～36） μm，且大部分蟲卵內含幼胚。

2.2.2 蟲卵大小 顯微鏡下觀察蟲體的大小有很大差異，其結果見表1。由表1可知，羊糞中長度小于60 μm的蟲卵較多，占42%；且蟲卵中含有幼胚，初步診斷為乳突類圓線蟲。

2.3 斯陶爾氏蟲卵計數法結果

斯陶爾氏蟲卵計數結果顯示每克羊糞中含蟲卵1 100個，屬于輕度感染。

2.4 幼蟲培養和蟲種鑒定結果

采用無菌糞汁法、羊糞堆丘法在28 ℃的條件下培養2～3 d均觀察到大量幼蟲，運動活潑。染色后具體的形態學觀察結果見圖3。根據以上形態學觀察結果，最終確診為綿羊乳突類圓線蟲病。

3 小結與討論

3.1 病料采集與幼蟲的培養

根據臨床癥狀觀察以及對所分離的蟲卵、孵化的幼蟲蟲體進行形態學的檢測，確認該羊場的羊只所患為乳突類圓線蟲病。為了保證試驗結果的準確性，蟲卵孵化試驗中的蟲卵必須在從宿主體內排出后3 h內使用；蟲卵只能在2～7 ℃保存，否則會影響卵的孵化過程。因為蟲卵孵化試驗要用新鮮的蟲卵，故在野外調查時難度較大。綿羊和山羊糞便中的線蟲卵保存通過糞樣的厭氧保存可以得到解決[7]。

糞便中的乳突類圓線蟲卵大多數在25 ℃溫水中經24 h發育為桿蟲型幼蟲，該幼蟲非常活躍，將含有該幼蟲的羊糞便經貝爾曼氏幼蟲分離時，幼蟲在數秒鐘內大多進入水中，并向試管下移動[8，9]。如果羊糞便中混雜有其他線蟲的幼蟲，因是第一期幼蟲，運動很慢，在數秒鐘內很少能進入水中，即使進入水中，其沉向試管底的時間也較長。因此本試驗在1 min內收集的大多為類圓線蟲的幼蟲。此外類圓線蟲絲蟲型幼蟲形態特異，其尾部有分叉，容易與其他的幼蟲區別。集卵后用無菌糞汁進行培養，培養皿底部放一平皿加水來調節濕度，這樣就可以少加糞汁，并且注意間隔一定的時間向培養皿內吹新鮮空氣[10]。

本試驗中羊糞堆丘法用鋸末加糞便進行培養不僅可使培養物疏松通氣，而且木質的吸水性具有調節培養物濕度的功能，從而保證蟲卵發育時所需的空氣和水分，進一步提高蟲卵發育率。

3.2 乳突類圓線蟲發病季節特征

乳突類線圓蟲蟲卵一年內在羊糞中出現有2個高峰，第一個高峰期在10月，第二個高峰期在5月。蟲卵出現的低谷在12月至次年的3月，即整個冬季[11]。本試驗中羊糞中的乳突類圓線蟲蟲卵處于第二個高峰期，這也是做出診斷的依據之一。據此規律，羊場宜在每年春、秋兩季用丙硫咪唑驅蟲1～2 次，可有效預防該病。

參考文獻：

[1] 孔繁瑤.家畜寄生蟲學[M].第二版.北京：中國農業大學出版社，1997.

[2] 趙樹英.動物寄生蟲學[M].第三版.山西太谷：山西農業大學出版社，2005.

[3] COLES G C，何國聲.世界獸醫寄生蟲學促進協會（WAAVP）對驅蠕蟲藥抗藥性的檢測方法[J].中國獸醫寄生蟲病，1996（1）：60-63.

[4]嚴若峰，徐立新，李祥瑞.捻轉血矛線蟲純凈3期幼蟲制備方法的改進[J].畜牧與獸醫，2009（1）：86-88.

[5] HENRIKSEN S A.A method for culture and recovery of gastrontestinal wtrongyle larvae[J].Nord Veter，1983，35：429-430.

[6] 王慶賢.馬圓線蟲類幼蟲培養方法的改進及溫度、濕度對幼蟲發育的影響[J].中國獸醫雜志，1959（7）：217-220.

[7] 張西臣，李建華.動物寄生蟲病學[M].北京：科學出版社，2009.

[8] 姚寶安，王乾蘭.蘇云金芽孢桿菌毒素對羊捻轉血矛線蟲第三期幼蟲毒力研究[J].畜牧獸醫學報，1995，26（4）：358-361.

[9] 葉明忠，沈 杰，陳永軍.羊乳突類圓線蟲在體內及牧場上消長規律的研究[J].湖北畜牧獸醫，1994（2）：13-15.

[10] 韓 謙.蒙古馬歇爾線蟲人工培養及其發育各階段的形態學研究[D].北京：北京農業大學，1988.

[11] 王治才，徐志光，李建軍，等.綿羊糞便中毛圓線蟲卵培養和感染性幼蟲分離法的比較[J].中國獸醫寄生蟲病，2004，12（2）：4-6.