基于psbA—trnH序列的劍麻H.11648原始母本的鑒定

金剛　陳濤　蘇文潘　黃強(qiáng)　覃旭　呂平　覃劍峰　王春田

摘要：劍麻H.11648（Agave hybrid No.11648）是以藍(lán)劍麻（A. amaniensis）和假菠蘿麻（A. angustifolia）為親本進(jìn)行雜交，F(xiàn)1再與藍(lán)劍麻回交選育而來。分析了劍麻H.11648及其兩個(gè)親本葉綠體psbA-trnH序列的差異。結(jié)果表明，劍麻H.11648與藍(lán)劍麻的psbA-trnH存在1個(gè)明顯的SNP差異，而在該位點(diǎn)與假菠蘿麻保持一致，從葉綠體DNA水平證實(shí)了劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)來源于假菠蘿麻。

關(guān)鍵詞：劍麻H.11648（Agave hybrid No.11648）；藍(lán)劍麻（A. amaniensis）；假菠蘿麻（A. angustifolia）；psbA-trnH

中圖分類號(hào)：S563 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2513-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.057

劍麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）是龍舌蘭科（Agavaceae）所屬單子葉植物的統(tǒng)稱，也稱為龍舌蘭麻。該科有9屬293種，大多原產(chǎn)于墨西哥一帶，龍舌蘭屬是該科中最重要的一個(gè)屬[1]。劍麻纖維具有色澤潔白、質(zhì)地堅(jiān)韌、富有彈性、拉力強(qiáng)、耐磨擦、耐酸堿、耐腐蝕、不易打滑等特點(diǎn)，已成為目前用量最大、范圍最廣的一種硬質(zhì)纖維。由于劍麻的原產(chǎn)地不在中國，我國的劍麻種質(zhì)資源比較匱乏，育種工作相對(duì)滯后，劍麻栽培品種單一化的問題相當(dāng)嚴(yán)重[2]。目前，我國劍麻種植區(qū)的當(dāng)家品種為H.11648，其種植面積占98%以上，其他栽培品種廣西76416和番麻主要用于補(bǔ)植。劍麻H.11648是由東非坦桑尼亞劍麻試驗(yàn)站育成，該品種是以假菠蘿麻（A. angustifolia）為母本、藍(lán)劍麻（A. amaniensis）為父本進(jìn)行雜交，獲得有性雜種第一代（F1），再利用開花的F1作為親本與藍(lán)劍麻回交而獲得有性雜種回交一代（BC1），通過系比、選擇而育成[3-5]。但有些研究資料記載劍麻H.11648的雜交選育過程為（藍(lán)劍麻×假菠蘿麻）×藍(lán)劍麻[6]。這一問題可以歸結(jié)為劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)究竟來源于藍(lán)劍麻還是假菠蘿麻。

運(yùn)用物種特異的DNA序列信息位點(diǎn)，能夠給劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)來源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。psbA-trnH片段是位于葉綠體基因組上psbA基因和trnH基因之間的一段非編碼序列，長(zhǎng)約300 bp，可用于植物屬間及種間的系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究基于劍麻葉綠體基因組的遺傳信息，分析了劍麻H.11648、藍(lán)劍麻和假菠蘿麻psbA-trnH序列的差異，以期揭示劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 劍麻H.11648及其原始親本假菠蘿麻和藍(lán)劍麻的新鮮幼嫩葉片均取自廣西亞熱帶作物研究所龍舌蘭麻種質(zhì)資源圃。

1.1.2 生化試劑 Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和dNTPs購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pUCm-T載體、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體psbA-trnH序列PCR擴(kuò)增 采用改進(jìn)的CTAB法提取劍麻總DNA[7]。psbA-trnH序列擴(kuò)增的參考通用引物，trnH2R（GUG）：5′-GCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′；psbA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′[8]。PCR反應(yīng)采用20 μL擴(kuò)增體系，包括DNA模板1.0 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL、Primer F（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Primer R（2.5 μmol/L） 1.0 μL、Pfu DNA聚合酶0.2 μL、超純水12.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2 psbA-trnH序列測(cè)定 利用Pfu酶擴(kuò)增3份材料的葉綠體psbA-trnH序列后，再向反應(yīng)液里加入5 U的Taq DNA酶，混勻后置于72 ℃反應(yīng)30 min，進(jìn)行簡(jiǎn)易的加A反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用1.1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。回收純化目的片段后，連接至T載體后進(jìn)行DH5α大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色陽性克隆交由華大基因公司測(cè)序。

1.2.3 多重比對(duì) 應(yīng)用DNAman 6.0.3.99軟件對(duì)劍麻H.11648、藍(lán)劍麻和假菠蘿麻的psbA-trnH序列進(jìn)行多序列同源性分析，參數(shù)取原始默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 psbA-trnH序列的PCR擴(kuò)增

利用psbA-trnH序列的通用引物，以劍麻H.11648、藍(lán)劍麻和假菠蘿麻的葉片總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，從劍麻H.11648、藍(lán)劍麻和假菠蘿麻中均擴(kuò)增出約700 bp的單一條帶。

2.2 劍麻H.11648與其親本psbA-trnH序列比較

多重比對(duì)結(jié)果表明，3份種質(zhì)psbA-trnH序列的相似度很高，僅存在2個(gè)SNP位點(diǎn)。其中一個(gè)為藍(lán)劍麻與另外2份種質(zhì)的C/T差異。第二個(gè)SNP位點(diǎn)在假菠蘿麻中出現(xiàn)，表現(xiàn)為1個(gè)胸腺嘧啶的缺失。由于該處出現(xiàn)連續(xù)的胸腺嘧啶，有可能是由于Pfu DNA聚合酶的不穩(wěn)定擴(kuò)增導(dǎo)致（圖2）。因此，未將第二個(gè)SNP位點(diǎn)作為判斷劍麻H.11648原始母本來源的判斷依據(jù)。由于被子植物細(xì)胞質(zhì)基因組母系遺傳的特征，結(jié)合劍麻H.11648的系譜關(guān)系，從第一個(gè)SNP位點(diǎn)即可判斷其原始母本為假菠蘿麻。

3 小結(jié)與討論

植物細(xì)胞質(zhì)基因分布在葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，與核基因一樣，具備完備的復(fù)制與表達(dá)功能，但其遺傳方式卻不遵守孟德爾遺傳定律。葉綠體在裸子植物中一般為父系遺傳，而在被子植物中多為母系遺傳[8，9]。本研究利用Pfu高保真酶的擴(kuò)增進(jìn)而通過測(cè)序獲得的psbA-trnH序列信息。按照母系遺傳的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，后代與母本的質(zhì)體遺傳信息具有一致性。本研究結(jié)果表明，藍(lán)劍麻與另外2份種質(zhì)存在一個(gè)C/T的SNP位點(diǎn)差異，而假菠蘿麻和劍麻H.11648在同一位點(diǎn)保持一致，即確定了劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)來源于假菠蘿麻。藍(lán)劍麻、假菠蘿麻和劍麻H.11648的psbA-trnH序列差異從葉綠體基因水平上為劍麻H.11648的細(xì)胞質(zhì)來源提供了可靠的參考依據(jù)。結(jié)合前人的資料記載，本研究確定了劍麻H.11648是通過（假菠蘿麻×藍(lán)劍麻）×藍(lán)劍麻的雜交方式選育而成，而并非（藍(lán)劍麻×假菠蘿麻）×藍(lán)劍麻。本研究為劍麻細(xì)胞質(zhì)育種的母本選擇提供了參考依據(jù)，也為psbA-trnH序列應(yīng)用于龍舌蘭屬植物的系統(tǒng)分類奠定了基礎(chǔ)。

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