GEF7基因過表達擬南芥植株幼苗表型分析

摘要：利用已構建的過表達擬南芥（Arabidopsis）GEF7基因植株，在光照培養箱中進行培養，并與野生型植株進行對比分析，對GEF7基因過表達植株的幼苗表型進行了觀察分析。結果表明，GEF7基因過表達植株幼苗的根長比野生型對照明顯增加；其子葉形態、數目和幼苗形態等方面均有異常表型，表明GEF7基因的功能與根的發育有關，并參與調控植物的發育過程。

關鍵詞：擬南芥（Arabidopsis）；GEF7基因；根；植物生長發育

中圖分類號：Q945 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2511-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.056

Rac/ROP GEFs（Guanine nucleotide exchange factor）稱為Rac/ROP鳥嘌呤核苷酸交換因子，是小G蛋白Rac/ROP的上游活化因子，能催化小G蛋白由GDP結合態轉化為GTP結合態。Rac/ROP作為一種分子開關調節植物多種生長發育以及參與多種信號途徑，其中包括調節花粉管的生長、根毛的發育、過氧化氫的產生以及參與生長素、脫落酸等植物激素的信號轉導途徑[1]。擬南芥基因組中存在14個Rac/ROP GEFs基因，是近年來鑒定的一個新的基因家族[2]。關于植物Rac/ROP GEFs生物學功能的研究目前比較少，僅有Rac/ROP GEFs調控擬南芥、煙草和番茄花粉管的極性生長的報道[3]。聶芳[4]已經構建了GEF7P-GUS轉基因植株，通過GUS組織化學染色法分析GEF7基因的表達模式，發現GEF7基因主要在幼苗根的分生組織和維管組織、側根原基和根毛細胞表達，且經生長素（NAA）誘導處理后，在上述細胞的表達顯著增強。因此，本研究對GEF7基因表達植株的幼苗根系發育情況進行分析，同時對轉基因植株的表型也進行了觀察分析，旨在為闡明GEF7基因功能的奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 GEF7基因過表達擬南芥植物種子來自華南農業大學植物激素信號轉導分子機理實驗室。

1.1.2 試劑及儀器 Trypton 和Yeast Extract 購自OXOID公司，卡那霉素（Kan）購自廣州康龍公司，其余試劑均為國產分析純產品。熒光顯微鏡（BX51，OLYMPUS公司），光照培養箱（XT5408，杭州雪中炭公司），超凈工作臺（SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GEF7基因過表達植株幼苗根系發育分析 利用已構建的35S-GEF7 T1代陽性苗繼續繁殖至T3代，轉基因種子和野生型種子消毒后，在超凈臺內用無菌水清洗數次，將種子傾倒于滅菌濾紙上，保持濾紙的濕潤。將種子播種至1/2平板上（添加50 mg/L卡那霉素），將種子排成一條線并保持一定間距（便于后面側根數目觀察），將平皿放入光照培養箱內，豎立培養3～9 d，在顯微鏡下觀察苗的主根長度，進行拍照，運用ImageJ軟件測量苗的主根長度。

1.2.2 GEF7基因過表達植株幼苗表型分析 篩選得到35S-GEF7 T1代陽性苗后，繼續篩選繁殖后代，以期得到純合子。期間觀察35S-GEF7植株T1、T2、T3代的幼苗的表型，以野生型（WT）為對照。

2 結果與分析

2.1 GEF7基因過表達植株幼苗根系發育分析

以GEF7基因過表達植株的各株系幼苗進行根系發育分析試驗，發現GEF7基因過表達植株在幼苗期主根的長度明顯長于野生型對照（圖1A）。對過表達及野生型對照的3、7、9 d幼苗的主根長度在顯微鏡下進行了定量分析，結果見圖1B。正常的野生型植株分生組織區域的細胞通常通過垂周分裂來加長細胞組成的縱向行列，可以進一步在顯微鏡下對幼苗主根的分生組織進行觀察，找出導致主根長短差異的原因。推測在過表達植株根分生組織區域可能分裂方式發生變化，也可能是分生組織細胞數目發生了變化。

2.2 GEF7基因過表達植株子葉和幼苗發育分析

野生型擬南芥幼苗的子葉通常是兩片，并且大小對稱（圖2A），表型微弱的35S-GEF7幼苗常出現各種異常形狀的子葉，如兩片子葉大小不對稱（圖2D）、子葉鉆石型（圖2F）等；表型嚴重的35S-GEF7幼苗會出現一片子葉（圖2E）、三片子葉（圖2B）甚至子葉融合（圖2C）等現象（這些表型35S-GEF1植株也都有，GEF1和GEF7都是Rac/ROP GEFs基因家族中的成員）。

野生型擬南芥幼苗的兩片子葉對稱打開，兩葉柄之間形成一個較大的角度（圖3苗1、6）。35S-GEF7幼苗的表型有：下胚軸膨大（類似于乙烯的效應）（圖3中苗2～5）；兩葉柄很寬，且夾角很?。▓D3苗2）；子葉發育缺陷，如子葉肥厚、不能伸展（圖3苗5），或一片子葉發育不全（圖3苗3、4）；無根或根很短的苗較少（圖3苗7、8）等。

GEF是小G蛋白Rac/Rop的上游活化因子，GEF7基因過表達的幼苗表型與ROP組成型活化態的表型一致，暗示著GEF7可能在小G蛋白ROP調控器官的發育中起作用。

3 結論與討論

3.1 GEF7與生長素信號途徑

GEF的直接靶蛋白是Rac/Rop GTP酶，它能夠催化Rac/Rop由GDP結合的非活化態轉變為GTP結合的活化態，活化的小G蛋白可以和下游的各種效應分子相互作用，進而執行不同的細胞生理功能。Tao等[5]、Himanen等[6]闡明了ROP GTPase參與生長素信號途徑的新機制，位于細胞膜的ROPGTPase其活性受生長素調節，其被生長素活化后，通過Aux/IAAs選擇性降解，從而介導生長素誘導基因的表達。有研究表明，擬南芥GEF12在調節花粉管生長的過程中與上游受體激酶AtPRK2a作用并將信號傳遞給下游的ROP GTPase[7]。當GEF7基因過表達時，幼苗主根顯著增長，表明Rac/Rop GEF7可能參與生長素介導的根發育的信號途徑，這需要進一步的試驗來證明，如對35S-GEF7轉基因植株的根進行激素敏感性試驗等。

3.2 GEF7與植物器官發育

植物中ROP GTPase作為一種分子開關調節各種各樣生理功能以及參與各種信號途徑，其中包括調節花粉管的生長、側根的發生，根毛的發育、過氧化氫的產生、細胞骨架的組裝以及參與生長素、脫落酸等植物激素信號轉導途徑[8-10]。GEF7基因過表達的植株子葉和幼苗表型呈現出各種異常形態，其中含有類似乙烯效應的表型，推測GEF7可能在小G蛋白ROP調控器官的發育中起作用。

參考文獻：

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