陳 宇，董映雪，鄭 璐,盧智城

（莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

近年來(lái)，人們對(duì)人工合成的抗氧化劑越來(lái)越不信任而轉(zhuǎn)向?qū)邆涓咝Аo(wú)毒、安全等特點(diǎn)的天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和研究上.竹子，在中國(guó)是最主要的植物之一，有著漫長(zhǎng)的藥、食兩用的歷史，在開(kāi)發(fā)中醫(yī)藥和保健品方面有很高的價(jià)值.竹子資源豐富，但我國(guó)現(xiàn)今對(duì)其開(kāi)發(fā)利用的情況較差[1].竹葉含有大量的黃酮類(lèi)化合物，另外還含有生物多糖、氨基酸、活性肽等微量元素[2-3].有研究表明竹葉提取物具有顯著的抗氧化、抗疲勞、降血脂等作用[4-7].所以在未來(lái)的市場(chǎng)發(fā)展中，竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的應(yīng)用將占據(jù)極大的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)，極大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力.本文以莆田學(xué)院校園內(nèi)的竹子葉片為材料，測(cè)定竹葉黃酮的抗氧化性能，為竹子的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

將“佛肚竹”的竹葉（采自莆田學(xué)院芳名湖畔）清洗干凈，于50.0℃的烘箱中烘干.置于絞碎機(jī)中絞碎后，經(jīng)80目篩子過(guò)篩，稱取5.0000g的竹葉粉末，濾紙包好.在料液比為1:20（60%的乙醇溶液），溫度為60.0℃的水浴條件下加熱4h，得到竹葉的浸取液.60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)對(duì)竹葉浸取液進(jìn)行濃縮，接著用石油醚對(duì)濃縮液進(jìn)行萃取以除去葉綠素，將除去葉綠素的濃縮液定容成50mL，過(guò)濾，留待備用[8].

用乙醇溶液（同上提取竹葉提取液所用的溶劑）配制0.200mg·mL-1的蘆丁溶液.稱取5.0000g的NaNO2于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成5%的NaNO2溶液.稱取8.8000g的Al(NO3)3于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成5%的Al(NO3)3溶液.稱取10.0000g的NaOH于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成10%的NaOH溶液，備用.

根據(jù)陳宇等[9]前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)得到竹葉提取液的黃酮類(lèi)物質(zhì)的總濃度C=0.0224g·L-1.稱取0.2240g的抗壞血酸和BHT，以60%的乙醇溶液為溶劑將其定容到100mL的容量瓶中，配成濃度C=2.24g·L-1的溶液，使用時(shí)稀釋100倍.

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1試劑

鄰苯三酚、鹽酸、1,10-菲啰啉、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、2，6二叔丁基對(duì)甲酚、抗壞血酸、亞硝酸鈉、石油醚、無(wú)水乙醇等均為分析純.DPPH為生物試劑，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99%，鄭州荔諾生物科技有限公司）.

1.2.2 主要儀器

BS224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；722型分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司制造）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DGH-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；PHS-25酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）.

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 對(duì)有機(jī)自由基（DPPH）的清除能力的實(shí)驗(yàn)

用無(wú)水乙醇配制濃度為 0.26mmol·L-1的DPPH溶液，在冰箱中避光保存.實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至6.5×10-5mol·L-1的 DPPH溶液[10].

分別取 6.5×10-5mol·L-1的 DPPH乙醇溶液5mL+乙醇1mL、5mL的DPPH溶液+竹葉黃酮提取 液（100μL、200μL、400μL、600μL、800μL）、5mL乙醇+100μL竹葉黃酮提取液于試管中，定容混合均勻后室溫避光反應(yīng)10min后于517nm處測(cè)其吸光度，分別記為 A0、Ai、Aj.用抗壞血酸和 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較.所有測(cè)定平行進(jìn)行三次.

所得的吸光度代入下式計(jì)算提取液對(duì)有機(jī)自由基（DPPH）的清除率.

清除率=1-(Ai-Aj)/A0

1.3.2 對(duì)羥基自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)分光光度比色法來(lái)測(cè)定.參照羅宇倩的方法略有改動(dòng)[11].

配制1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液、磷酸鹽緩沖溶液 PBS（pH=7.24）、1.5mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液、0.02%的過(guò)氧化氫溶液，備用.

取5只比色管，分別標(biāo)記為損1、未損1、空參1、樣1、樣參1.分別在損1、未損1和樣1中加入1 mL的鄰二氮菲和1mL的硫酸亞鐵溶液；接著在各個(gè)試管中加入2mL的PBS；在樣1和樣參1中分別加入200μL的竹葉提取液；最后分別量取1mL的過(guò)氧化氫加到損1和樣1中，蒸餾水定容.搖勻，靜置一段時(shí)間后，在536nm處測(cè)其吸光度.分別記為 A樣、A損、A未損.

同理分別測(cè)定當(dāng)竹葉提取液加入的量不同（0.2mL、0.5mL、1mL、2mL）時(shí)的吸光度.

所得的吸光度代入下式計(jì)算提取液對(duì)羥基自由基的清除率.

清除率=（A樣-A損）/(A未損-A損)

1.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)

根據(jù)李鵬婧等[12]的方法略做改動(dòng).配制Tris-HCl溶 液 （50mmol·L-1，pH分 別 為 7.24、8.15、9.19），Tris溶液（50mmol·L-1，pH為 10.23），3mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，備用.

取四支試管，分別標(biāo)記為空7.24、空參7.24、樣7.24、樣參7.24.先在四支試管中加入pH=7.24的Tris-HCl溶液各5mL；在空7.24試管中加入1.5mL的蒸餾水，空參7.24試管中加入2mL，樣7.24試管中加入1.3mL的蒸餾水，空參7.24試管中加入1.8mL的蒸餾水；接著在樣7.24和樣參7.24試管中分別加入0.2mL的竹葉提取液，搖勻，靜置一段時(shí)間.然后在空7.24和樣7.24分別迅速加入0.5mL的鄰苯三酚，計(jì)時(shí)，搖勻，每30s測(cè)定吸光度.分別記為A空、A樣.

不同pH值的Tris-HCl溶液（pH分別為7.24、8.15、9.19、），Tris溶液（pH為 10.23）步驟同上，測(cè)定吸光度.

確定最佳的pH值的Tris-HCl溶液，配制溶液并同理分別測(cè)定當(dāng)竹葉提取液加入的量不同（0.00mL、0.03mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL）時(shí)的吸光度.

所得的吸光度代入下式計(jì)算提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率.

清除率=（A空-A樣）/A空

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.1.1 不同抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除效果的影響

由圖1可以看出隨著抗氧化劑加入量的增加，溶液的吸光度總體的趨勢(shì)都是降低的.其中竹葉提取液即竹葉黃酮類(lèi)化合物對(duì)DPPH自由基的清除作用是最明顯的.從圖1還可以看出的是竹葉黃酮類(lèi)化合物的加入量在0.2mL的時(shí)候就已經(jīng)有顯著的清除效果，隨著竹葉黃酮類(lèi)化合物的加入量的增多，溶液的吸光度A趨向于0.3；并且加抗壞血酸的溶液的吸光度是隨著其加入量的增加而減少，即其清除作用是隨著抗壞血酸的加入量的增加而加強(qiáng)；而B(niǎo)HT的抗氧化性總體上是隨著B(niǎo)HT的加入量的增多而加強(qiáng).比較圖1的三條曲線可以看出竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除效果明顯會(huì)比抗壞血酸的好，抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除效果又會(huì)比BHT的清除效果來(lái)的好，即少量的竹葉黃酮類(lèi)化合物便能對(duì)DPPH自由基的清除作用達(dá)到很好的效果，而抗壞血酸和BHT對(duì)DPPH自由基的清除作用相對(duì)沒(méi)有竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的好.并且抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用是隨著加入量的增加而增大并且逐漸趨向于0.6；竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除作用則是在竹葉提取液加入量為0.2mL的時(shí)候便達(dá)到了74.73%，之后隨著其加入量的增加清除率緩慢上升，即竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化效果會(huì)優(yōu)于抗壞血酸和BHT.

2.1.2 不同反應(yīng)時(shí)間竹葉提取液對(duì)DPPH自由基的清除效果的影響

由圖2可以看出竹葉提取液對(duì)DPPH自由基有很好的清除能力.當(dāng)竹葉的提取液加到0.2mL的時(shí)候竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了73.53%.由此可以看出竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除作用，只需要加入少量的提取液便可達(dá)到很好的抗氧化作用.隨著竹葉提取液的加入量的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除作用增加，并逐漸趨向于1.

比較圖2和圖3同樣可以看出隨著竹葉提取液即竹葉黃酮類(lèi)化合物的用量的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除作用增加，并且放置15min后測(cè)定的清除率都稍高于即時(shí)測(cè)定的.

圖2 竹葉提取液用量對(duì)DPPH自由基的清除率（t=0min）

圖3 竹葉提取液用量對(duì)DPPH自由基的清除率（t=15min）

2.2 竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除能力

由圖4可以看出隨著提取液加入量的增加其對(duì)羥基自由基的清除效果逐漸提升.由此可以證明竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗氧化性能.

圖4 竹葉提取液的用量對(duì)羥基自由基的清除率

2.3 竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.3.1 pH對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的影響

由圖5-1可以看出加提取液的溶液的吸光度與未加提取液的溶液的吸光度都隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，溶液的吸光度有微弱的上升.這表明溶液在中性的條件下只能使鄰苯三酚發(fā)生微弱的自氧化反應(yīng)產(chǎn)生有色的中間產(chǎn)物，使溶液的吸光度有微弱的上升.加提取液的溶液的吸光度會(huì)稍小于未加提取液，其部分原因是顏色中和的結(jié)果.

由圖5-2可以看出加提取液的溶液的吸光度的上升幅度比未加提取液的溶液的吸光度的上升的幅度小，但都有明顯的上升趨勢(shì).這說(shuō)明Tris-HCl的pH=8.15的時(shí)候，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有色的中間產(chǎn)物使溶液的吸光度上升，加竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)后，抗氧化劑和超氧陰離子很快的進(jìn)行反應(yīng)，使吸光度減少.所以加提取液的溶液的吸光度會(huì)比未加提取液的溶液的吸光度低，加提取液的溶液的吸光度的上升趨勢(shì)會(huì)比未加提取液溶液的小.

由圖5-3可以看出在Tris-HCl的pH=9.19的時(shí)候，未加提取液的溶液的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，且在200s的時(shí)候趨于0.4，而加提取液的溶液的吸光度的上升幅度較小，且在90s的時(shí)候溶液的吸光度已經(jīng)接近0.15，清除速度過(guò)快，不適于實(shí)驗(yàn)觀察.

由圖5-4可以看出未加提取的溶液的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)增大，且趨向于0.35，而未加提取液的溶液則是隨反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)其吸光度緩緩沒(méi)有大的變化，其在60s的時(shí)候已接近對(duì)超氧陰離子的清除完全.這表明在Tris的pH=10.23的溶液也不適于實(shí)驗(yàn)觀察.

圖5 不同pH值的竹葉提取液對(duì)超氧陰離子的清除率（A：pH=7.24；B：pH=8.15；C：pH=9.19；D：pH=10.23）

總之，由圖5可以得到在Tris-HCl的pH=8.15左右的時(shí)候是最適于實(shí)驗(yàn)研究的.即與文獻(xiàn)查到的在Tris-HCl溶液的pH=8.20中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究是相符的[10,11,12].

2.3.2 黃酮類(lèi)物質(zhì)用量對(duì)清除超氧陰離子自由基的影響

由圖6可以看出隨著竹葉提取液的加入量的增加，竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)超氧陰離子的清除率是隨之增大的，其清除率從開(kāi)始的快速上升到逐漸趨向于1.

圖6 竹葉提取液的用量對(duì)超氧陰離子的清除率（t=420s）

3 討論

本文研究竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性能是通過(guò)對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用來(lái)驗(yàn)證的.

李安林等[13]研究結(jié)果表明對(duì)DPPH自由基的清除作用是隨著黃酮的用量成正比.王乃馨等[14]研究結(jié)果表明野馬追類(lèi)黃酮的濃度與其對(duì)DPPH自由基清除活性間存在量效關(guān)系，并且野馬追類(lèi)黃酮對(duì)DPPH自由基的清除效果大體的趨勢(shì)是：前5min較快，之后變緩，30-50min達(dá)平緩.王毅紅等[15]研究對(duì)比車(chē)前草黃酮類(lèi)化合物與相同濃度下的VC和VE清除DPPH自由基的效果，結(jié)果表明黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性能會(huì)顯著高于相同濃度下的VC和VE.與本文研究結(jié)果是相一致的，即相同濃度下，竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的清除效果會(huì)優(yōu)于抗壞血酸和BHT；并且隨著提取液的濃度的增加其清除效果逐漸提升.

蔡為榮[16]的研究結(jié)果表明對(duì)羥基自由基的清除率與荷葉黃酮的用量存在量效關(guān)系.陸海峰等[17]的研究表明蒲公英的黃酮提取液對(duì)羥基自由基具有清除作用，其清除能力是隨著提取液的濃度的增加而增大的.

李利華[18]的研究結(jié)果表明在試驗(yàn)的范圍內(nèi)，黃酮類(lèi)化合物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用與其用量呈正相關(guān).李穎暢等[19]的研究結(jié)果也表明清除作用與濃度間的關(guān)系，即隨著黃酮的用量的增加，黃酮對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用就越強(qiáng).

潘娜[10]研究發(fā)現(xiàn)濃度為100mg·mL-1的竹葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率為24%，當(dāng)濃度為l000 mg·mL-1時(shí)對(duì)超氧陰離子的清除率為94%；竹葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率為30.7%，對(duì)應(yīng)的濃度是5μg·mL-1，當(dāng)竹葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除率為84.5%，對(duì)應(yīng)的竹葉黃酮的濃度是25μg·mL-1；對(duì)DPPH自由基的清除作用也是同樣的，即隨著濃度的增大，清除作用就越好.李鵬婧等[14]研究結(jié)果同樣驗(yàn)證了黃酮用量與清除率之間的關(guān)系，即黃酮的濃度越大，抗氧化效果就越好.本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是隨著竹葉提取液即竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的加入量的增加，竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)三者的清除作用是逐漸增強(qiáng)的，與文獻(xiàn)的結(jié)果是相符的.

4 結(jié)論

竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除效果隨竹葉提取液的加入量的增加而增大，且實(shí)驗(yàn)具有良好的重現(xiàn)性.隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除效果就越佳.竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除效果顯著，其次是抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除效果，再次是BHT，由此說(shuō)明竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性能優(yōu)于抗壞血酸和BHT.

竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除效果與竹葉提取液的加入量呈量效關(guān)系.由此也驗(yàn)證了竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性能.

竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)在Tris-HCl的pH=8.15的時(shí)候?qū)Τ蹶庪x子自由基有明顯的清除效果，與文獻(xiàn)一致.竹葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用隨反應(yīng)時(shí)間的增加其吸光度的變化逐漸減少，并且隨著竹葉提取液的加入量的增加，其對(duì)超氧陰離子的抑制作用增強(qiáng).

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