奶牛乳腺上皮細胞的分離培養

高瑞峰 施月桃

(長春科技學院,吉林長春 130600)

奶牛乳腺上皮細胞的分離培養

高瑞峰 施月桃

(長春科技學院,吉林長春 130600)

從荷斯坦奶牛乳房無菌采取乳腺組織,以組織塊培養法,建立成熟的奶牛乳腺上皮細胞體外培養體系,觀測長出的上皮細胞在各生長時期的形態變化,純化奶牛乳腺上皮細胞。結果表明:組織塊接種可以得到大量細胞用于原代培養,從而可以進行后期的體外實驗。

乳腺上皮細胞;分離;組織塊培養

1 材料

1.1 奶牛乳腺組織來源

奶牛乳腺組織塊采自健康的泌乳期荷斯坦奶牛（來源于長春市皓月屠宰場）。用無菌手術剪剪取乳腺組織，置于 37℃生理鹽水中保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1：250）、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 IU/ml，生化培養箱，光學顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯）等。

2 方法

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養

2.1.1 奶牛乳腺組織培養前的處理

（1）一部分乳腺組織用4% 甲醛溶液固定；另一部分乳腺組織用于乳腺上皮細胞的分離培養。

（2）用37℃生理鹽水將用于細胞分離培養的乳腺組織洗滌數次，直至清除組織中所有的血跡、乳汁及其他雜質。

（3）在無菌操作臺中，先用無菌的手術剪將乳腺組織周圍脂肪和結締組織去除，使乳腺腺泡暴露出來。

（4）將獲得的腺泡組織在75% 酒精中浸潤約 1min，再用0.01M PBS（含有100IU青霉素和100IU鏈霉素）洗滌 3 次。

（5）將腺泡組織置于無菌的青霉素小瓶中，用無菌的小眼科剪將其剪切成約 1mm3大小的組織塊，備用。

2.1.2 奶牛乳腺上皮細胞組織塊培養法

（1）將上述剪切完全的乳腺組織塊用牙科探針平鋪于體積為50ml 的卡氏細胞培養瓶中，植塊間距為 0.5cm，應盡量使乳腺組織塊的切面向下粘附于細胞培養瓶壁上。

（2）經細胞培養瓶側壁緩慢加入 5ml DMEM/F-12（含10%FBS）細胞培養液，蓋緊瓶蓋。

（3）將有組織塊的一面朝上，37℃培養箱中靜置 2～3h 后，使組織塊微干。

（4）將卡氏細胞培養瓶翻轉過來，使組織塊完全浸沒于細胞培養液中，每3d 更換一次新鮮的細胞培養液，待細胞密度為90%時，無菌條件下用牙科探針將組織塊完全去除，沖洗換液。

2.2 奶牛乳腺上皮細胞的形態學觀察

奶牛乳腺上皮細胞37℃ 培養24h后，在光學顯微鏡下觀察乳腺上皮細胞形態學并照相。

3 結果

奶牛乳腺上皮細胞在24～48h內貼壁，其形態由圓形逐漸呈多角形，具有典型上皮細胞形態。37℃培養72h后，細胞鋪滿培養板，呈單層鋪路石狀，如下圖。

奶牛乳腺上皮形態學觀察

[1] 丁月云，張莉莉，陳莎莎，等.組織塊種植法體外培養奶牛乳腺上皮細胞[J].南京農業大學學報，2008，3l（4）：91-96.

[2] 王治國，王傳蓉，王加啟.不同方法分離奶牛乳腺上皮細胞體外培養的研究[J].乳業科學與技術，2009，（1）：35-38.

[3] Kadegowda AK，Bionaz M，Piperova L S，et a1.Peroxi—some proliferator··activated receptor··gamma activationand long·chain fatty acids alter lipogenie genenetworksin bovine mammary epithelial cells to various extents[J].J Dairy Sci，2009，92（9）：76-89.

[4] 陳建暉，佟慧麗，李慶章，等.奶牛乳腺上皮細胞系的建立[J].畜牧獸醫學報，2009，40（5）：743-747.

[5] 崔立莉.奶牛乳腺上皮細胞體外培養體系的建立及其應用[D].新疆農業大學，2006.