紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中抗氧化作用的研究

廖梓亙 陳慧

紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中抗氧化作用的研究

廖梓亙 陳慧

目的 探討紅花注射液（SI)在大鼠腦缺血/再灌注損傷中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響。方法 將40只健康SPrague-Dawley大鼠隨機分為假手術組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只，分別在再灌注24h測定超氧化物歧化醉(SOD)活性和丙二醛（MDA）的含量，再灌注24h后取梗死灶腦組織行HE染色。結果 小劑量紅花組和大劑量紅花組SOD活性較缺血/再灌注模型組及假手術組有顯著增強（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的SOD活性增強更明顯（t=79.871,P=0.000）；小劑量紅花組與大劑量紅花組MDA含量較缺血/再灌注模型組及假手術組有顯著減少（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的MDA含量減少更明顯（t=-1.314,P=0.000）。結論 紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中通過增強機體SOD活性,降低MDA含量，達到其保護作用。

大腦中動脈閉塞；紅花注射液；超氧化物歧化酶；丙二醛

急性腦缺血損傷是目前發病率高、病死率高、致殘率高，嚴重威脅著人類健康的疾病，尋求保護方面的研究是主要目標之一。研究發現，腦缺血/再灌注損傷后產生大量氧自由基等炎性因子，從而說明氧化應激機制是腦缺血/再灌注損傷的主要機制之一。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是體內的主要氧自由基清除劑之一，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質過氧化物產物之一，因此，通過具有清除氧自由基的藥物對缺血/再灌注損傷有神經保護作用。

紅花為菊科植物,具有活血通經、祛瘀止痛的功效,是傳統的活血化瘀類中藥,主要成分有紅花苷、紅花素、黃花素和總黃酮等，具有明顯降低腦缺血大鼠腦線粒體MDA含量、升高SOD活性、抑制Ca2+過多攝入[1]，本研究通過觀察不同劑量的紅花對大鼠腦缺血/再灌注損傷后細胞形態學及SOD活性及MDA含量的影響，探討紅花對腦保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實驗動物及分組 40只清潔級健康雄性SD大鼠，雌雄不限，體質量200～250g,由南華大學實驗動物中心提供，許可證號：SYYK-025。本實驗研究嚴格參照中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》[2]。40只大鼠隨機分成假手術組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只。

1.2 方法 造模成功后2h小劑量紅花組及大劑量紅花組分別腹腔注射紅花注射液1mL/kg和3mL/kg(山西華衛有限公司)；假手術組,缺血/再灌注模型組分別腹腔注射等量的生理鹽水。實驗動物模型的制備及評分參照Koizumi[3]方法制成大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模術后2h觀察大鼠的癥狀和體征,采用Longa[4]評分標準進行。0分：正常（無神經功能障礙）；1分：上肢不能完全伸展；2分：爬行時向左側劃圈；3分：爬行時向左側傾倒；4分：無自發性活動伴意識障礙。剔除0分與4分；符合評分標準，但有蛛網膜下腔出血、術后死亡者，亦予以剔除，并隨機補充。

1.3 腦缺血再灌注后體積的測量 各組SD大鼠腦缺血模型分別在缺血2h后再灌注24h后，再次評分后，深度麻醉后并斷頭取腦，以視交叉和其后4mm處兩點冠狀切片，逐層切成2mm厚的腦片，置于2%的3，5-三苯基氯化四氮唑TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，觀察腦組織：正常腦組織呈紅色，腦缺血組織呈白色。

1.4 HE染色觀察 所有大鼠缺血/再灌注24h后，再次評分，斷頭取腦后，取得的所有腦組織均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋,組織連續冠狀切片，HE染色。

1.5 SOD活性測定 將各組大鼠經心臟取血4mL，4000r/min離心15min，取上清液30μL，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，按試劑盒說明操作。

1.6 MDA含量測定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定。將經心臟取血4mL，離心半徑為4cm,離心速度為4000r/ min離心15min，取上清100μL，采用TBA比色法測定MDA含量，按試劑盒說明操作。

1.7 統計學方法 用SPSS20.0統計軟件進行統計分析。計量資料采用“x±s”表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經功能評分及腦梗死體積的影響 根據Longa評分，假手術組評分最低，無神經功能障礙；缺血/再灌注模型組評分最高，神經功能受損最嚴重。小劑量紅花組及大劑量紅花組神經功能評分與缺血/再灌注模型組比較有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組神經功能評分改善更顯著（t=0.869,P=0.000）。小劑量紅花組及大劑量紅花組腦梗死體積與缺血/再灌注模型組比較，也有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組腦梗死體積改善也更顯著（t=18.276,P=0.000）。見表1。

表1 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經功能評分及腦梗死體積的影響(x±s，n=10)

2.2 HE染色 顯微鏡下可見：假手術組：神經細胞胞質深染，核仁形態正常、飽滿；缺血再灌注模型組：神經細胞大量變性壞死，細胞間間隙明顯增寬，細胞間質空泡改變，細胞稀少，細胞水腫明顯，胞體縮??；小劑量紅花組：神經細胞部分變性壞死，存活的神經細胞較多，凋亡細胞相對減少，細胞水腫明顯，部分細胞形態相對正常；大劑量紅花組：神經細胞少部分變性壞死，存活的神經細胞增多，凋亡細胞減少，多數細胞形態正常。見圖1。

圖1 大鼠腦缺血/再灌注損傷24小時腦組織病理組織變化（HE染色×400）

2.3 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的影響 小劑量紅花組、大劑量紅花組SOD活性和缺血/再灌注模型組與假手術組相比較有顯著增高（均P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組SOD活性增高更顯著（t=79.871,P=0.000）。小劑量紅花組、大劑量紅花組MDA含量和缺血/再灌注模型組與假手術組相比較有顯著減少（P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組MDA含量減少更顯著（t=-1.314,P=0.000）。見表2。

表2 紅花注射液對腦缺血/再灌注損傷后的超氧化物歧化酶和丙二醛的影響(x±s，n=10)

3 討論

既往研究發現，氧化應激是腦缺血/再灌注損傷的機制之一，腦缺血/再灌注損傷后激活大量的酶性物質引發一系列信號級聯反應,產生大量氧自由基，導致一系列病理生理改變。抗氧化物質不斷清除體內過多的氧自由基,以保持體內內環境自由基的動態平衡，不發生自由基連鎖反應和組織損傷[5]。腦缺血后，啟動氧化應激機制，使得體內SOD消耗過多，MDA生成增加，動態平衡打破，導致神經細胞變性壞死進一步加重。氧化應激機制可能通過以下途徑：（1）氧自由基激活炎性因子：如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1（IL-1）等大量釋放，致使小膠質細胞被激活產生大量的炎癥反應；（2）進一步損害細胞蛋白質、糖和脂肪酸等導致細胞變性壞死；（3）氧自由基還可損傷腦細胞的DNA,進而和其他機制共同作用最終導致細胞凋亡；（4）加速體內三羧酸循環代謝，更進一步增加了氧自由基的產生，造成細胞內游離Ca2+增加,鈣離子超載的作用進一步增加,致上述惡性循環反復進行而加重腦損傷。

近年來的研究表明，紅花注射液目前被人們所廣泛認可并主要用于治療冠心病、心絞痛、脈管炎等多種血液循環障礙疾病的治療[6]。紅花注射液具有鎮痛、抗氧化、降脂、抗炎等作用，對血栓形成有一定抑制作用[7]，還可以能明顯減輕由腦卒中引起的腦水腫[8]，改善血管阻力、擴張血管、增加腦部血流量、改善及增加纖維蛋白溶酶的活性、加強血栓溶解等，對血小板凝集有抑制作用，對缺氧缺血組織具有保護作用，紅花注射液具有減輕腦梗死患者的神經損傷[9-10]及改善血液動力學的作用[11]。本研究結果顯示，Longa評分越高，神經功能損害越嚴重，所以缺血/再灌注模型組評分最高，神經功能受損最嚴重；予以紅花注射液后，評分下降明顯，神經功能損害顯著改善，尤其以大劑量紅花組更為明顯。紅花注射液組腦梗死體積較缺血/再灌注模型組明顯縮小，而紅花注射液中以大劑量組梗死體積縮小更明顯，提示紅花注射液在一定劑量的范圍內，劑量越大，神經功能損害及梗死體積縮小越明顯。

HE染色顯示，缺血/再灌注模型組的神經細胞損害最嚴重，細胞凋亡最明顯，細胞核變性壞死最嚴重，相比予以紅花注射液腹腔注射后，神經細胞得到一定程度的改善，細胞凋亡減少，細胞形態部分正常；而大劑量紅花注射液組提示細胞形態、細胞數及核仁明顯改善。結果表明，紅花注射液具有保護作用，與以往結果相一致[12]。

本研究結果顯示，與假手術組比較，缺血/再灌注模型組的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增高，提示氧化應激參與了腦缺血/再灌注損傷的病理生理過程，2h再灌注后24h后取血再檢查，小劑量紅花組及大劑量紅花組SOD活性與缺血再灌注模型組和假手術組相比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中大劑量紅花組比小劑量紅花組SOD活性增高值高，提示紅花注射液能提高大鼠腦缺血血液中SOD活性。

綜上所述，紅花注射液對大鼠腦缺血/再灌注后，可以改善神經功能評分,改善缺血區域的供血，減少腦梗死體積方面差異均有統計學意義,使得缺血/再灌注后細胞學形態得到明顯改善，神經元細胞數量明顯增加，提高缺血區SOD活性和減少MDA含量，尤以提高SOD的含量顯著,表明紅花注射液具有較強的抗自由基作用，從而對缺血/再灌注起到保護作用。

[1] 田京偉，傅風華，蔣王林，等.羥基紅花黃色素A對腦缺血所致大鼠腦線粒體損傷的保護作用[J].藥學學報，2004，39(10)：774.

［2］ 中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見[S]. 2006-09-30.

[3] Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al．Experimental studies of ischemicbrain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J]．Stroke，1986，8（1）：1-8.

[4] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91．

[5] Suzuki J．Chemiluminescence in hypoxic brain[J]．Stroke，1988，19：65.

[6] 林濤．紅花注射液對冠心病患者冠脈血流、抗氧化能力及脂質代謝的影響[J].重慶醫學，2012，41（31）：3267-3269.

[7] 王來銀.紅花注射液的臨床應用概況[J].中國藥物經濟學，2013，10(11)：66-67.

[8] 懂澤宏，佘靖.中藥現代研究與應用(第三卷)[M].北京：學院出版社，1998：2057.

[9] 徐開蕾，范華昌，劉龍民，等.紅花注射液頸動脈灌注治療腦梗死的療效及對大鼠腦線粒體影響的研究[J].中成藥，2010，32（9）：1472-1476.

[10] 秦松苗.紅花注射液治療急性腦梗死療效觀察[J].中國實用神經疾病雜志，2011，14（12）：86-87.

[11] 趙欣欣，黃蘭，唐發寶.紅花注射液對腦梗死血液流變學影響的Meta分析[J].中國藥房，2011，22（15）：1413-1415.

[12] 歐芹，魏曉東，孫鵬，等.紅花黃色素對衰老模型小鼠腦細胞凋亡的影響[J].中國康復醫學雜志，2006，21（6）：504.

Objective To investigate the effect of safflor injection on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury. Methods 40 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, ischemia reperfusion model group, low dose group, large dose of safflor group, 10 rats in each group. The contents of SOD activity and MDA were measured by 24h assay, and the HE staining was performed after reperfusion 24h. Results The activity of SOD was significantly enhanced in the small dose group and large dose group (P＜0.05), and the SOD activity was significantly higher in the large dose group (t=79.871，P=0.000 ), and the MDA in the low dose group and the sham operation group (t=-1.314，P=0.000). Conclusion The effect of safflor injection on the SOD activity and the protective effect of MDA in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury was reduced.

Middle cerebral artery occlusion；Safflor injection;Superoxide dismutase；Malondialdehyde

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.003

湖南 421001 南華大學附屬第二醫院神經內科（ 廖梓亙） 廣東510288 廣州市中山大學孫逸仙紀念醫院南院急診科（ 陳慧）