兩種方法檢測LGC盲樣及效果探討

韓毅 彭浩

兩種方法檢測LGC盲樣及效果探討

韓毅 彭浩

目的 檢測LGC盲樣中的小腸結腸炎耶爾森氏菌并對過程和結果進行探討。方法 ①分離培養法。②實時熒光PCR法。結果 兩者均檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌。結論 兩種方法的有效結合對目標菌檢出有更重要的意義。

盲樣；小腸結腸炎耶爾森氏菌；分離培養法；實時熒光PCR法

小腸結腸炎耶爾森氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，20世紀80年代才受到人們的重視，不少地區耶氏菌引起的胃腸炎和嚴重腹瀉，比痢疾還多。1981年我國才發現此病，通過全國性調查和研究，發現其在我國的分布非常廣泛，80年代中期證實過曾有兩次大流行[1]。本菌是一種嗜冷菌，在0～4℃仍能繼續繁殖并產生毒素。在冰箱內存放的污染該細菌的食品對人仍具有感染性[2]。鑒于小腸結腸炎耶爾森氏菌的危害性，很多國家都已將該菌列為食品的常規檢測項目。本檢測中心為了提高中心實驗室的小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測能力，向英國LGC申請該菌的國際盲樣考核，并通過常規鑒定法和PCR法對該盲樣進行了實驗。

1 材料與方法

1.1 標本來源 英國LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化學家實驗室)提供的凍干粉25 g。

1.2 培養基、試劑及儀器

1.2.1 分離培養法的培養基、試劑及儀器 改良磷酸鹽緩沖液(PSB)、CIN-1培養基、改良Y培養基、改良克氏雙糖培養基、尿素酶、動力半固體、糖發酵管由北京陸橋試劑有限公司提供；API鑒定系統、API-20E生化試劑條及其配套試劑，VITEK2全自動細菌鑒定儀及VITEK2-GN鑒定卡購自法國梅里埃公司。

1.2.2 實時熒光PCR法試劑及儀器 小腸結腸炎耶爾森氏菌核酸測定試劑盒 (實時熒光PCR法)購自上海之江生物科技有限公司；AB 7500 FAST型Real-Time PCR儀購自美國杜邦公司。

1.3 方法

1.3.1 分離培養 無菌操作稱取25 g凍干粉放入裝有225 mL改良磷酸鹽緩沖液的無菌均質袋中，26℃增菌72 h，參照食品衛生微生物學檢驗小腸結腸炎耶爾森菌檢驗方法(GB/T4789.8－2008)[3]進行。取增菌液作堿處理，分別接種到CIN-1平板、改良Y平板上，26℃培養48 h。挑取可疑菌落接種改良克氏雙糖，并做初篩的生化鑒定(尿素酶、鼠李糖、26℃和37℃培養下動力)，符合以上反應者用API－20E生化試劑條和VITEK2全自動細菌鑒定儀做進一步的生化鑒定。

1.3.2 實時熒光PCR法 從上述分離培養的26℃增菌72 h的改良磷酸鹽緩沖液中取出2 mL，用離心管13 000 rpm離心2 min，去盡上清；在沉淀中加入100 μL DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min；13 000 rpm離心5 min，取上清4 μL與小腸結腸炎耶爾森氏菌核酸熒光PCR檢測混合液35 μL、內部對照品1 μL、酶(Taq+UNG)0.4 μL，振蕩混勻數秒，3 000 rpm離心數秒，立即進行PCR擴增反應。設置循環參數：37℃×2 min；94℃×2 min；再按93℃×15 sec→60℃×60 sec，循環40次，單點熒光檢測在60℃。同時進行陽性對照品、陰性對照品試驗。循環結束后，觀察熒光曲線。

2 結果

2.1 分離培養結果 在CIN－1瓊脂平板上多為紅色、周圍帶較小透明環的菌落或紅色無透明環的菌落。所有菌落均較為圓整，但大小不一，雖都為紅色，但略有色差。在改良Y瓊脂平板上多為無色透明、不黏稠的菌落，大小不一，也是略有色差。根據經驗推斷，該盲樣中混入了除目標菌外的其他雜菌。因此，對CIN-1平板、改良Y平板上的多個不同菌落均進行分離純化，挑取形態最接近目標菌的菌株進行鏡檢和生化初篩。初篩的生化鑒定中，改良克氏雙糖接種管產酸不產氣、尿素酶陽性、鼠李糖陰性、26℃培養下有動力，37℃培養下無動力。將該疑似菌落用API-20E生化試劑條和VITEK2全自動細菌鑒定儀進行鑒定。兩者鑒定結果均為小腸結腸炎耶爾森氏菌，API-20E可靠性為95%(表1)，VITEK2可靠性為99%(表2)。

表1 小腸結腸炎耶爾森氏菌API－20E生化試劑條鑒定結果

表2 小腸結腸炎耶爾森氏菌VITEK2全自動細菌鑒定儀鑒定結果

2.2 實時熒光PCR結果 (圖1) 盲樣的熒光曲線在21個循環處呈光滑的上升拋物線，峰值出現在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陽性對照品的熒光曲線在10個循環處呈光滑的上升拋物線，峰值同樣出現在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陰性對照品則呈不規則的折線圖。比較陽性對照品的熒光曲線和盲樣的熒光曲線可以判斷盲樣為小腸結腸炎耶爾森氏菌檢出。

圖1 實時熒光PCR結果

3 結論

我國現階段食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測主要以傳統分離培養為主，它是所有檢測方法的金標準。但是按照國標上的方法進行培養時間較長，檢測完成周期也較長。而且從CIN-1平板、改良Y平板上的菌落形態來看，有些非目標菌同國標上小腸結腸炎耶爾森氏菌的描述也很吻合。在此次的盲樣考核中，作者就受到了很大的干擾。在CIN-1平板上分離出與小腸結腸炎耶爾森氏菌菌落形態很相似的一種菌，通過染色鏡檢，初步生化，最終生化，才確定其是一種大腸埃希氏菌。由于此類雜菌和目標菌的競爭，導致目標菌在選擇性平板上生長的很少，這就給分離檢出帶來了困難。實時熒光PCR方法由于具有實時監測反應進程、快速、特異性強以及靈敏性高等優點而成為國外目前檢驗該菌的主要方法。但由于食品體系較復雜且雜菌率較高以致檢出率較低，所以在使用實時熒光PCR方法檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌之前增菌是十分必要的[4]。在經過PSB的增菌以后，使用實時熒光PCR進行擴增，從熒光曲線結果來看，單位容積內的DNA數量有明顯的呈指數級的擴增現象，而將未經增菌的PSB凍干粉溶液擴增后結果顯示基本為陰性。將這兩者直接轉種至CIN-1平板上時，前者跟后者一樣都很難直接分離出目標菌，原因可能是PSB在增菌的過程中選擇性并不是很強，目標菌和雜菌都在大量的生長，而雜菌在CIN-1平板上的生長又優于目標菌，導致平板上的目標菌菌落過于稀少，這就給分離檢出帶來了困難。而將PSB增菌液進行堿處理后的效果就好的多，在CIN-1平板上也較容易分離出目標菌。因為耶爾森氏菌對弱堿具有較高的抵抗力，用弱堿液迅速處理15 s，可以殺死大部分不耐堿的其他細菌，能提高小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢出率[5]。

綜上所述，實時熒光PCR法檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌速度快，周期短，但是普遍共知的是PCR法雖然靈敏度高，但是易出現結果的假陽性和假陰性。傳統分離培養雖然周期長，操作繁瑣且要求檢測人員有豐富的經驗，但是其檢測的穩定性和把握性也更高。目前的有利條件是引進了全自動生化鑒定儀，這就給后期的確證帶來了極大的方便和保證。兩種方法均有自己的優勢與不足，如何將兩種方法有機的結合，創造出一套切實有效的操作模式，為我們的檢測工作服務，這還有待于我們的進一步思考和研究。

[1]于恩庶.中國小腸結腸炎耶爾森氏菌病研究進展[J].中華流行病學雜志，2000，21(6)：453-455．

[2]龔霄，陳盼.肉中革蘭氏陰性食源性致病菌[J].肉類研究，2008，22(5)：32-46.

[3]中華人民共和國衛生部.食品衛生微生物學檢驗小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2008．

[4]牛蕾，祝長青，周光宏，等.小腸結腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇[J].食品科學，2011，32(5)：168-171．

[5]張昕，張惠媛，汪琦，等.小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測[J].檢驗檢疫科學，2008，18(6)：23-26

Objective To detect Yersinia enterocolitica in LGC blind sample and probe into the process and results.Methods ①Isolated culture method.②Real-time fluorescence PCR method.Results Yersinia enterocolitica was detected by both methods.Conclusion The effective combination of the two methods has more important significance to detect Yersinia enterocolitica.

Blind sample；Yersinia enterocolitica；Isolated culture；Real-time fluorescence PCR method

2014-05-06)

1005-619X(2015)01-0087-03

10.13517/j.cnki.ccm.2015.01.046

214023無錫市疾病預防控制中心