淡紫灰鏈霉菌X33發酵產物的毒性試驗評價

段栓成　張宇坤　吳曉玉等

摘要：利用小白鼠進行急性和亞急性經口毒性試驗，研究抑制柑橘綠霉病菌的淡紫灰鏈霉菌菌株X33無菌發酵液對小鼠的毒性，并測定小白鼠血常規指標，觀測小鼠主要臟器。結果表明，菌株X33無菌發酵液的小鼠LD50>10.0 g/kg，受試物屬于無毒級物質；小白鼠經28 d喂養，各試驗組小白鼠生長發育良好，體質量、食物利用率及血常規與對照組之間無顯著差異；對小白鼠肝、腎、脾、胃、腸、十二指腸、睪丸（或卵巢）等主要臟器進行組織解剖，均未見病變。淡紫灰鏈霉菌菌株 X33無菌發酵液對小鼠安全、無毒。

關鍵詞：淡紫灰鏈霉菌X33；無菌發酵液；毒性試驗；小白鼠；血常規

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0275-02

柑橘采后損失主要由霉菌、酵母菌、細菌等病原菌侵染造成，其中，柑橘青霉病和綠霉病是柑橘采后主要的兩大貯藏病害。據統計，由于青霉病和綠霉病感染導致的柑橘采后損失率為30%～50%[1]。目前，柑橘采后病害主要使用化學藥劑進行防治，這容易污染環境，使病原菌產生抗藥性，防病效果降低[2]。此外，頻繁和高濃度使用化學藥劑，不僅會影響果實的自然風味和質構，果實表面還會存在殘留，威脅消費者的健康和安全。

生物防治是采用微生物菌株或抗生素類物質，通過噴灑或浸漬果實處理，以降低或防治果實采后病害的保鮮方法，高效、無毒、生產成本低廉，是未來的發展方向[3]。江西南昌市發酵應用技術重點實驗室以柑橘綠霉病菌為靶標，開展菌株的分離和篩選研究，從土壤中分離篩選到1株淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae），命名為淡紫灰鏈霉菌X33，其產生的生物活性物質對柑橘綠霉病菌、柑橘青霉病菌、柑橘酸腐病菌等多種病原菌均有較強的抑制活性，有望開發為新型的柑橘采后防腐劑。本研究通過對淡紫灰鏈霉菌X33發酵液進行毒理學試驗，旨在探討淡紫灰鏈霉菌X33發酵液的使用安全性，為其進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淡紫灰鏈霉菌X33，由江西省南昌市發酵應用技術重點實驗室分離得到。

1.1.2 受試物 淡紫灰鏈霉菌X33在28 ℃、200 r/min下搖瓶發酵培養3 d，發酵液經6 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾，即得無菌發酵液。

1.1.3 試驗動物及試劑 遠交昆明小鼠，自南昌大學醫學院購買；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 急性經口毒性試驗 選用體質量為18～22 g的小白鼠20只，分2個試驗組，每組雌雄各5只，采用一次性經口灌胃方式，灌胃菌株X33無菌發酵液20 mL/kg，劑量相當于 10 g/kg；另取10只小白鼠（雌雄各半），給清水作為對照。小鼠首次飼喂時，隔夜空腹，禁食16 h，僅喂水；試驗前先正常飼喂3 d，使其適應試驗環境。灌胃后，連續14 d觀察小白鼠的行為狀況、中毒癥狀，記錄各組實驗小鼠死亡數，并及時剖檢并記錄結果。

1.2.2 亞急性經口毒性試驗 選小白鼠80只，隨機分為4組，每組20只，雌雄各半。試驗設灌胃菌株X33發酵液1、05、0.01 g/kg共3個劑量組，以灌胃蒸餾水為對照組。每天觀察并記錄各組小白鼠的體征表現、行為、中毒癥狀和死亡情況[4]。自由進食飲水，每周稱量1次體質量，記錄飲水量、食物攝入量，計算食物利用率[5]。

1.2.3 發酵液對小白鼠血常規指標和主要臟器的影響 亞急性經口毒性試驗結束，從每籠中隨機抓取3只小白鼠，頸椎脫臼法處死，立即用注射器插入心臟采集血液，分析血液生化指標，并同時進行組織解剖檢查。

2 結果與分析

2.1 急性經口毒性試驗

試驗期間，各試驗組小白鼠飲食和活動正常，生長發育良好，體質量有所增加，未見任何明顯中毒表現，也無死亡；小白鼠喂養14 d進行解剖，肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與對照組相比，皆未發現明顯病變和差異。紫灰鏈霉菌X33無菌發酵液的飼喂劑量達10 g/kg時不會引起小白鼠死亡，按現行2005年《化學品毒性鑒定技術規范》急性經口毒性試驗的毒性分級標準[6]劃分，受檢物屬于無毒級物質。

2.2 亞急性經口毒性試驗

2.2.1 一般觀察結果 喂養28 d，對照組與喂養組小白鼠均未出現死亡現象，各處理組小白鼠的生長狀況、行為狀態、外觀體征、飲食和排便等均與對照組差異不明顯，淡紫灰鏈霉菌X33無菌發酵液對小白鼠生理功能損害不明顯。

2.2.2 喂養28 d的小白鼠進食量和食物利用率 由表1可知，各處理組與對照組之間差異不顯著（P>0.05），淡紫灰鏈霉菌X33無菌發酵液喂養小白鼠，對小白鼠體質量增加、進食量和食物利用率影響不明顯。

2.3 發酵液對小白鼠血常規指標的影響

由表2可知，各飼喂劑量組的小白鼠紅細胞、白細胞、血小板及血紅蛋白數均在正常范圍之內，淡紫灰鏈霉菌X33發酵液對小白鼠的血常規指標影響不明顯。

2.4 發酵液對小白鼠主要臟器的影響

對各組小白鼠進行組織解剖，發現各處理小白鼠肝、腎、脾、胃、腸、十二指腸、睪丸和卵巢等主要臟器的顏色、形狀、大小均未見病理改變，未見膀胱、肝膽管結石，肝體比、腎體比、脾體比、睪丸體比和卵巢體比等臟器參數與對照組差異不顯著（P>0.05），較長期服用淡紫灰鏈霉菌X33無菌發酵液對小白鼠的組織解剖學結構影響不明顯。

3 結論與討論

拮抗微生物可利用其代謝產物抑制病原菌的生長繁殖，其產生的抑菌活性物質種類繁多，主要有細菌素、揮發性物質、蛋白酶類、脂肽及多肽類等等，這些物質通過干擾敏感病原菌的代謝過程而抑制其生長[7]。以枯草芽胞桿菌為例，人們已從枯草芽胞桿菌不同菌株中分離出幾十種抗菌物質，在柑橘病害防治中顯示出巨大潛力。Leelasuphakul等從土壤中分離到205株枯草芽胞桿菌，其中23株對柑橘綠霉病菌均具有較好的拮抗性，有望開發為柑橘采后保鮮的生防菌[8]。淡紫灰鏈霉菌不同種類菌株可發酵產生鏈絲菌素、薰衣草菌素、中生菌素和農抗402[9-10]，可用于防治番茄灰霉病、番茄葉霉病、葡萄白腐病、西瓜枯萎病和蘋果輪紋病等[9，11-15]。endprint

江西省南昌市發酵應用技術重點實驗室從土壤中分離篩選得到淡紫灰鏈霉菌X33，其發酵產物對柑橘綠霉病菌、柑橘青霉病菌、柑橘酸腐病菌等多種植物病原菌均有較強的抑制活性，而有關淡紫灰鏈霉菌用于防治柑橘采后綠霉病的相關毒理學試驗未見研究報道。本試驗結果表明，淡紫灰鏈霉菌X33發酵產物對小白鼠LD50>10g/kg，屬安全無毒物質；小白鼠喂養發酵液28 d，其行為體征、生長發育、體質量增加量、食物利用率、血液生化指標、臟體及組織病理學的不良影響均不明顯，可見淡紫灰鏈霉菌X33發酵液對小白鼠具有較好的安全性。

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