黑木耳凝集素的提取工藝

鄧政東　程愛芳　蒲玉婷

摘要：以黑木耳為原料，采用磷酸緩沖液浸提，在料液比、浸提時間、浸提溫度等單因素試驗的基礎上，設計正交試驗，以研究黑木耳凝集素的最佳提取工藝。結果表明，以磷酸鹽緩沖液為提取劑，料液比1 g ∶15 mL，提取溫度為 30 ℃，提取時間為16 h條件下，黑木耳凝集素的凝集活性最高，達到0.742。

關鍵詞：黑木耳；凝集素；提取工藝；凝集活性

中圖分類號： S646.601；R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0259-02

黑木耳（Auricularia auricula）營養豐富，是我國傳統的食藥兼用菌，含有多糖、凝集素、三萜類等藥用成分，具有提高免疫功能、抗癌、降血脂等功效。隨著雙孢菇、靈芝、金針菇和口蘑等真菌凝集素及抗腫瘤效果的發現，真菌凝集素的作用被逐漸認識，它具有凝集細胞、活化淋巴細胞、免疫調節、抑制癌細胞、抑制植物病原真菌等作用[1-3]。我國是黑木耳的生產和消費大國，研究黑木耳中包括凝集素在內的多種活性成分的提取工藝，對黑木耳的開發和利用具有重要意義。本研究利用磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸提法，采用正交試驗，優化提取工藝條件，以期為黑木耳凝集素在食品、醫藥、保健方面的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑木耳干品從市場購買，經粉碎、篩分、密封后存放于陰涼處備用。雞血由武漢生物工程學院基礎生物學實驗室提供。試驗所需試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑木耳凝集素的提取方法 取黑木耳干品粉末2.5 g，選取合適的提取試劑，以料液比1 g ∶20 mL在4 ℃條件浸提過夜。浸提液經過濾，4 000 r/min冷凍離心30 min。上清液加入固體硫酸銨至飽和度為50%，4 ℃鹽析12 h。沉淀經冷凍離心、透析后，用PBS溶解，獲得凝集素粗品。

1.2.2 凝集活性的測定 采用孫冊等的方法[4]，檢測凝集效價，即凝集素倍比稀釋后，加入等量的2%雞紅細胞懸液，靜置1 h觀察結果。根據紅細胞凝集分類標準，判定紅細胞凝集效價[5]。參照趙則海等的方法[6]，對凝集效價定性數據賦值，取其加權平均數作為量化的凝集活性（agglutinating activity，Aa）。以凝集活性為指標，篩選提取的最佳工藝。

1.2.3 提取劑的選擇 分別以PBS（0.05 mol/L，pH值7.2）、0.9%NaCl、蒸餾水作為提取劑，提取黑木耳凝集素，血凝法檢測凝集效價和凝集活性，確定最佳提取試劑。

1.2.4 單因素試驗 以黑木耳凝集素的凝集活性為指標，以PBS為提取試劑進行單因素試驗。料液比分別為 1 g ∶10 mL、1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL；提取溫度分別為4、20、30、40 ℃；提取時間分別為6、12、18、24 h，確定各因素對試驗的影響。

1.2.5 正交試驗設計 選取料液比、提取溫度、提取時間3個因素，以凝集活性為指標，進行L9（33）正交試驗，試驗設計見表1，對黑木耳凝集素的提取最佳工藝進行研究 [7-8]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖2可知，隨著提取劑PBS用量的增大，提取的凝集素凝集活性也增大，料液比1 g ∶15 mL時，凝集活性基本達到最高；此后隨著提取劑用量的增加，凝集素凝集活性有下降的趨勢。提取劑用量少會導致提取率低和提取液黏稠，而用量過多會使提取液濃縮工作的負荷增加，因此確定最佳料液比為 1 g ∶15 mL。

2.2.2 提取溫度對黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖3可知，在4～30 ℃，黑木耳凝集素的凝集活性隨溫度升高而增加，30 ℃時達到最高；溫度超過30 ℃時，凝集活性明顯下降。結果表明黑木耳凝集素對溫度比較敏感，提取溫度過高可能導致凝集素變性失活，凝集活性下降，因此提取溫度應選擇30 ℃。

2.2.3 提取時間對黑木耳凝集素凝集活性的影響 由圖4可知，提取時間在12 h以內，黑木耳凝集素的凝集活性隨著提取時間的延長而增加，12 h時達到峰值；此后，隨著提取時間的延長，凝集素的凝集活性緩慢下降。綜合考慮凝集素的提取率、凝集活性以及提取進度，確定提取時間為12 h。

2.3 正交試驗

正交試驗結果和極差分析見表2，方差分析結果見表3。影響黑木耳凝集素提取因素的主要順序為：提取時間（C）>提取溫度（B）>料液比（A）。由表3可知，因素C有顯著差異，說明提取時間對凝集素凝集活性的影響最明顯；因素A、B沒有顯著差異，對凝集素凝集活性沒有顯著性影響。結合極差和方差分析、單因素試驗，確定黑木耳凝集素提取的最佳工藝參數是A1B2C3，即提取溫度30 ℃、料液比1 g ∶15 mL，浸提時間16 h。此組合沒有出現在正交表中，經過3次驗證試驗后，提取的凝集素的凝集活性平均為0.742，大于正交組合中的任一組合。

3 結論與討論

本試驗以單因素試驗和正交試驗相結合，對黑木耳凝集素提取工藝條件進行優化，得到最佳提取工藝為：以PBS為提取劑，料液比1 g ∶15 mL，提取溫度30 ℃，提取時間為 16 h，經飽和度50%的硫酸銨鹽析、透析后，獲得的黑木耳凝集素的凝集活性達到0.742。

本試驗以凝集素的凝集活性為指標，考察不同因素對提取的影響。在血凝法試驗中，如何確定凝集素提取液的凝集效價比較困難。相比較其他方法，通過對凝集效價加權平均數獲得量化的凝集活性，在凝集素提取及凝集活性研究中，可操作性更強。由于凝集素的本質是蛋白質或糖蛋白，蛋白質含量與凝集活性之間有相關性，因此在凝集素的提取過程中，可以參考蛋白質的提取和檢測方法。

參考文獻：

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