超聲強化提取紅菊苣總黃酮及其抑菌活性

王記蓮

摘要：以乙醇溶液浸提，結(jié)合超聲波輔助方法，采用L9（34）正交試驗研究紅菊苣總黃酮的最佳提取工藝，并采用紙片瓊脂擴散法考察紅菊苣提取物對幾種微生物的抑制作用。結(jié)果表明，總黃酮最佳提取工藝條件為：料液比1 g ∶20 mL，超聲功率200 W，提取溫度70 ℃，乙醇濃度50%；抑菌試驗結(jié)果表明，總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌、白假絲酵母菌均有一定的抑制作用。可見，紅菊苣含有豐富的總黃酮，具有體外抑菌活性。

關(guān)鍵詞：紅菊苣；總黃酮；提取工藝；超聲波輔助提取；抗菌活性

中圖分類號：S636.901；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0251-02

紅菊苣來源于菊科菊苣屬中的多年生草本植物菊苣，是維吾爾族和蒙古族習(xí)用藥材，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少，國外常用菊苣作為食品添加劑、營養(yǎng)飼料、果糖原料和咖啡替代品，20世紀(jì)80年代引入我國后，菊苣由于品質(zhì)優(yōu)良、飼用價值高，現(xiàn)已成為最有前途的飼料和經(jīng)濟作物之一[1]。現(xiàn)代研究表明，菊苣中含有三萜、倍半萜、香豆素、糖類等多種成分，具有保肝、降脂、促進消化等多種作用。總黃酮是在植物體內(nèi)廣泛存在的一類天然產(chǎn)物，其生物活性多種多樣，如對心血管系統(tǒng)的作用、抗肝臟病毒、抗炎、提高機體免疫力、雌激素樣作用、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-3]。超聲輔助提取是一種操作簡單、效率比較高的技術(shù)[4]，超聲空化可對細(xì)胞壁產(chǎn)生機械的修剪力，使細(xì)胞壁破裂，同時超聲可促進溶劑和活性成分的雙向轉(zhuǎn)移[5]。超聲波用于輔助從植物中提取活性物質(zhì)，可減少溶劑用量和提取時間，降低提取溫度，有利于熱敏感物質(zhì)和不穩(wěn)定物質(zhì)的提取。本研究采用超聲波強化提取紅菊苣中的總黃酮，并通過正交試驗確定超聲波輔助提取紅菊苣中總黃酮的最佳工藝條件，對紅菊苣提取產(chǎn)物進行體外抑菌試驗，以期為該資源的利用和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅菊苣采自江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)園。供試微生物菌株包括大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、青霉菌（Penicillium notatum）、白假絲酵母菌（Candida spp.），均購于中國微生物保藏中心。

主要試劑包括蕓香苷對照品，購于國藥集團；試驗用水為蒸餾水；試驗所用試劑均為分析純。

主要儀器有LC-5500型高效液相色譜儀，購于北京東西分析儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機，購于天津市泰斯特儀器有限公司；HZT-A+X型精密天平，購于上海鼎拓實業(yè)有限公司；超聲儀，購于江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水與甲醇（其體積比為30 ∶70），流速為 1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長360 nm，柱溫25 ℃，理論塔板數(shù)按蕓香苷峰計算應(yīng)不低于3 000 個。

1.2.2 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蕓香苷10.5 mg，在120 ℃下烘至恒質(zhì)量，用70%色譜級甲醇溶液溶解稀釋至50 mL，分別量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%色譜級甲醇溶液稀釋至10 mL，搖勻，得到不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將各標(biāo)準(zhǔn)溶液在“1.2.1”節(jié)中所述的檢測條件下測定色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和對應(yīng)測得的峰面積，制作出總黃酮含量對比基準(zhǔn)。

1.2.3 紅菊苣總黃酮的提取及其含量的測定

采集海洋生物園的紅菊苣莖、葉，晾干，粉碎，80 ℃下干燥2 h，按一定固液比加入不同濃度乙醇提取溶劑，選取不同超聲提取溫度和提取時間，放入超聲波儀中進行提取（提取時加回流裝置，以防溶劑損失），趁熱抽濾，收集提取液，加入與乙醇提取液體積比為1 ∶1的石油醚，萃取3～4次，脫去脂溶性雜質(zhì)，將乙醇溶液層轉(zhuǎn)入大孔吸附性樹脂柱，原液與樹脂量的比為 1 ∶2，依次用水、80%乙醇洗脫至溶液由淺黃色變?yōu)闊o色，收集乙醇溶液洗脫液，將洗脫液于50 ℃條件下堿液濃縮，得到紅菊苣總黃酮浸膏。取所得浸膏，用70%色譜級甲醇溶液稀釋成100 mL，搖勻，配制成待測溶液。

將所得待測溶液在“1.2.1”節(jié)中所述的檢測條件下測得待測溶液的峰面積值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線差查得該待測溶液濃度，即為待測液總黃酮含量，根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出紅菊苣中的總黃酮含量。

1.2.4 紅菊苣總黃酮提取工藝的L9（34）正交法試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，選出對紅菊苣總黃酮含量影響較大的4個主要試驗因素，考察紅菊苣總黃酮含量。根據(jù)L9（34）正交設(shè)計方案進行試驗，確定紅菊苣總黃酮的最佳提取工藝條件。

1.2.5 抑菌試驗

1.2.5.1 紅菊苣總黃酮抑菌活性的測定[6-7]

將滅菌后的專用藥敏紙片浸于50 mL浸提液中浸泡24 h，使其充分吸收提取液，以滅菌水為空白對照，采用紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，以反映供試品的抑菌能力。取0.1 mL液體培養(yǎng)基以活化培養(yǎng)好的供試菌，用無菌玻璃刮棒均勻涂布于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)平板上，用無菌鑷子將含有提取液的紙片貼于含菌瓊脂平板表面，紙片應(yīng)貼得均勻，各紙片中心距離不小于 24 mm，紙片至平板內(nèi)邊緣距離大于15 mm。在放好濾紙片的含菌培養(yǎng)皿中恒溫培養(yǎng)，其中細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌于28 ℃培養(yǎng) 48 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

1.2.5.2 最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定[8]endprint

用無菌水將紅菊苣總黃酮提取液稀釋，終濃度分別為0256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/mL。取2 mL提取稀釋液至15 mL培養(yǎng)基中，混勻，倒入平板，凝固后加入100 μL的100萬～1 000萬CFU/mL菌液，涂布均勻，放于相對濕度37%、溫度28 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，菌落被完全抑制的最高稀釋度提取物濃度即MIC；培養(yǎng)48 h后，菌落被完全抑制的最高稀釋度提取物濃度為MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.2.1”節(jié)的方法繪制得到蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到總黃酮濃度與吸光度的回歸方程：y=18 893x+38 546，r=0.997 2，可見在0～150 mg/L范圍內(nèi)總黃酮濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 紅菊苣總黃酮提取工藝優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗設(shè)計原理，以料液比、超聲功率、提取溫度、乙醇濃度4個因素進行L9（34）正交試驗（表1），對總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。

2.3 紅菊苣總黃酮的抑菌試驗結(jié)果

2.3.1 紅菊苣總黃酮的抑菌活性測定結(jié)果

使用優(yōu)化得到的方法提取紅菊苣中的總黃酮，得到的浸提液經(jīng)減壓蒸發(fā)去除乙醇。采用紙片瓊脂擴散法考察紅菊苣總黃酮對幾種模式微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母、青霉菌）的抑制特性，抑菌試驗結(jié)果見表3。試驗結(jié)果表明，紅菊苣總黃酮對青霉菌的抑菌效果最差，對白假絲酵母有一定的抑制作用，對潛在致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有很強的抑制作用，為紅菊苣藥物的抗菌臨床應(yīng)用提供了有力的證據(jù)并且有助于紅菊苣的進一步藥用開發(fā)。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取法，以紅菊苣總黃酮含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗法確定超聲波輔助提取紅菊苣總黃酮的最佳工藝提取條件為：料液比1 g ∶20 mL，超聲功率200 W，提取溫度70 ℃，乙醇濃度50%。在此條件下，總黃酮含量為21.042 mg/g。對紅菊苣總黃酮提取液的抑菌效果試驗結(jié)果表明，紅菊苣總黃酮具有較強的抗菌作用，對革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌具有抑制作用，為紅菊苣總黃酮的開發(fā)和利用提供參考。

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