地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)及對(duì)養(yǎng)殖水體中殘餌的降解特性

杭小英　周冬仁　羅毅志等

摘要：從自然養(yǎng)殖池塘中篩選獲得了1株能有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)致病菌的功能菌株DSY002-2011，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌。通過(guò)人工模擬養(yǎng)殖水體中殘餌濃度，研究地衣芽孢桿菌對(duì)飼料中蛋白質(zhì)、淀粉的降解特性。結(jié)果表明，分離株DSY002-2011在水溫28 ℃、pH值7的1%飼料培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，對(duì)飼料蛋白質(zhì)、淀粉的降解率分別達(dá)到58.8%、62.9%，說(shuō)明在養(yǎng)殖水體中添加地衣芽孢桿菌對(duì)水體殘余餌料的降解是非常有效的。地衣芽孢桿菌降解蛋白質(zhì)、淀粉的合適條件為pH值6～7、鹽度0～1.0%。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌；降解；鹽度；pH值

中圖分類號(hào)： X714 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0206-02

在高密度、集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，由于缺乏科學(xué)規(guī)范的養(yǎng)殖管理，養(yǎng)殖戶一味追求高產(chǎn)量往往會(huì)過(guò)度投餌，導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中積存了大量殘余餌料，加上養(yǎng)殖動(dòng)物的排泄物，使得養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物濃度增加，水質(zhì)環(huán)境惡化，從而誘發(fā)各類水產(chǎn)疾病。微生態(tài)制劑的調(diào)控技術(shù)已成為解決養(yǎng)殖水體污染病害問(wèn)題的有效手段之一[1-2]。以往研究表明，硝化細(xì)菌[3]、光合細(xì)菌[4]、芽孢桿菌[5-6]等有益菌在減少病害、凈化水質(zhì)和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等方面均有顯著效果，但對(duì)降解水體殘余餌料蛋白質(zhì)、淀粉的功能研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)用從自然養(yǎng)殖池塘篩選到的1株地衣芽孢桿菌DSY002-2011，對(duì)其餌料蛋白質(zhì)、淀粉的降解特性進(jìn)行研究，獲得其降解規(guī)律，為養(yǎng)殖水體的飼料殘餌去除探求一種更為有效的辦法，也為今后在水產(chǎn)養(yǎng)殖中科學(xué)使用地衣芽孢桿菌制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformi）DSY002-2011由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.1.2 飼料 市售鱉配合飼料，由優(yōu)質(zhì)白魚(yú)粉、淀粉、酵母粉、維生素、礦物質(zhì)等組成。

1.1.3 藥品與試劑 菌株生長(zhǎng)及試驗(yàn)所需藥品與試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、0.85%無(wú)菌生理鹽水、氯化鈉、蒸餾水、氫氧化鈉溶液、稀鹽酸等。

淀粉測(cè)定所需藥品與試劑：碘、碘化鉀、硝酸鈣[Ca（NO3）2·H2O]、可溶性淀粉。

蛋白質(zhì)測(cè)定所需藥品與試劑：硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀、硫酸、20 g/L硼酸溶液、混合指示液（1份1 g/L甲基紅乙醇溶液與5份1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合）、400 g/L氫氧化鈉溶液、0.050 0 moL/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

1.1.4 儀器 生化培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱、離心機(jī)、分光光度計(jì)、凱氏定氮儀、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、取樣器、試管、培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 1%飼料培養(yǎng)基 鱉飼料1.0 g，純凈水100 mL，混合后溶解均勻。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)與養(yǎng)殖水體中飼料殘餌降解的關(guān)系

將保存的地衣芽孢桿菌DSY002-2011在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，接種于pH值為7、滅菌后的1%鱉飼料培養(yǎng)基，28 ℃ 振蕩培養(yǎng)。接種后在0、24、48、72、96、120 h時(shí)取樣測(cè)定（從24 h時(shí)開(kāi)始測(cè)定）、蛋白質(zhì)含量、淀粉含量。

1.2.3 初始pH值對(duì)地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

配制1%鱉飼料培養(yǎng)基5份，pH值分別調(diào)為5、6、7、8、9，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，28 ℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至72 h時(shí)取樣測(cè)定蛋白質(zhì)、淀粉含量。

1.2.4 鹽度對(duì)地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

配制pH值為7的1%鱉飼料培養(yǎng)基6份，鹽度分別為0、0.5%、10%、1.5%、2.0%，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，28 ℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至72 h時(shí)取樣測(cè)定蛋白質(zhì)、淀粉含量。

1.2.5 細(xì)菌計(jì)數(shù)及細(xì)菌蛋白氮測(cè)定

地衣芽孢桿菌DSY002-2011接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h。將細(xì)菌培養(yǎng)液于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用生理鹽水反復(fù)吹打，重復(fù)以上步驟3次。將細(xì)菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，分別用血球計(jì)數(shù)板法（此方法可測(cè)得活菌和死菌的總量）和平板菌落計(jì)數(shù)法（此方法測(cè)得活菌數(shù)量即細(xì)菌生長(zhǎng)量）進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算兩者的比例。

細(xì)菌培養(yǎng)液潤(rùn)洗后于10 000 r/min離心10 min，棄液體，平鋪在濾紙上，37 ℃鼓風(fēng)干燥30 min，稱質(zhì)量，計(jì)算1 g細(xì)菌的數(shù)量（活菌和死菌的總量），并通過(guò)干燥恒重法（105 ℃）測(cè)定細(xì)菌水分含量，從而得出1 g細(xì)菌干物質(zhì)的質(zhì)量，再測(cè)定 1 g 細(xì)菌干物質(zhì)中的氮元素，采用半微量凱氏定氮法[7]。

1.2.6 飼料蛋白質(zhì)降解率的計(jì)算

地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)并不會(huì)使培養(yǎng)液中氮總量發(fā)生變化，只是將飼料蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成了細(xì)菌蛋白質(zhì)，所以轉(zhuǎn)化的飼料蛋白質(zhì)可以根據(jù)地衣芽孢桿菌培養(yǎng)前后含量變化來(lái)?yè)Q算。培養(yǎng)前的初始飼料蛋白質(zhì)含量由半微量凱氏定氮法測(cè)定，氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)是6.25。

飼料蛋白質(zhì)降解率=細(xì)菌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的飼料蛋白質(zhì)含量/培養(yǎng)前飼料蛋白質(zhì)含量×100%。

1.2.7 飼料淀粉降解率的測(cè)定

淀粉含量的測(cè)定采用碘顯色法[8]。飼料淀粉降解率=（培養(yǎng)前淀粉濃度-培養(yǎng)后淀粉濃度）/培養(yǎng)前淀粉濃度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)及細(xì)菌蛋白氮測(cè)定

平板計(jì)數(shù)法測(cè)得地衣芽孢桿菌活菌濃度為9.8×1010 CFU/mL，血球計(jì)數(shù)板法測(cè)得24 h培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌數(shù)量為3.0×1011 CFU/mL，兩者比例為1 ∶3.06。測(cè)得1 g地衣芽孢桿菌為5.3×1011個(gè)，細(xì)菌菌體水分含量為76%。半微量凱氏定氮法測(cè)得1 g地衣芽孢桿菌干物質(zhì)中含氮量為128%。測(cè)得2 mL模擬殘餌培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量為0.010 2 g， 100 mL培養(yǎng)瓶中飼料蛋白含量為0.51 g。

2.2 地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)與水體中飼料殘餌降解的關(guān)系

經(jīng)半微量凱氏定氮法測(cè)定，1%鱉飼料培養(yǎng)基中的初始飼料蛋白質(zhì)含量為5.1 mg/mL。在pH值為7的含1%鱉飼料培養(yǎng)基中，接種地衣芽孢桿菌后于28 ℃振蕩培養(yǎng)，表1結(jié)果表明，在培養(yǎng)液中，細(xì)菌數(shù)量迅速增加，并在96 h達(dá)到最大值；接種后24 h飼料蛋白質(zhì)、淀粉降解率分別為588%、629%；蛋白質(zhì)降解率在96 h時(shí)達(dá)到最大值74.5%，淀粉降解率在72 h時(shí)達(dá)到最大值72.1%。由此說(shuō)明，在培養(yǎng)液中地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)與蛋白質(zhì)、淀粉的降解具有同步的相關(guān)性。

2.3 初始pH值對(duì)地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

圖1結(jié)果表明，pH值為6～7時(shí)，地衣芽孢桿菌對(duì)蛋白質(zhì)和淀粉的降解效果比較好，在pH值為7時(shí)，蛋白質(zhì)、淀粉降解率達(dá)到最大值，分別為72.5%、72.1%。另外，pH值為 5～9 條件下，地衣芽孢桿菌飼料蛋白質(zhì)、淀粉降解率均接近或高于60%，說(shuō)明菌株降解飼料殘餌能力受pH值影響較小。

2.4 鹽度對(duì)地衣芽孢桿菌降解飼料殘餌能力的影響

由圖2可見(jiàn)，鹽度為0～2.0%條件下，地衣芽孢桿菌的蛋白質(zhì)降解率在50.2%～72.5%之間，淀粉降解率在 61.7%～72.1% 之間；鹽度為0時(shí)，地衣芽孢桿菌的蛋白質(zhì)、淀粉降解率均最高，隨著鹽度增加，蛋白質(zhì)、淀粉降解率均逐漸下降；鹽度超過(guò)1.0%后，蛋白質(zhì)降解率下降更快。試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽度為0～1.0%條件下，地衣芽孢桿菌對(duì)飼料蛋白質(zhì)、淀粉的降解效果較好。

3 結(jié)論與討論

高密度的養(yǎng)殖水體中，水質(zhì)的污染主要來(lái)源于大量殘余餌料、養(yǎng)殖動(dòng)物的糞便以及浮游生物的尸體等[9]，這些有機(jī)物的主要成分是蛋白質(zhì)和淀粉。這種水質(zhì)污染情況會(huì)隨著養(yǎng)殖期的發(fā)展越來(lái)越嚴(yán)重，尤其到養(yǎng)殖后期，成為各種病害頻發(fā)的誘因。本試驗(yàn)從自然養(yǎng)殖池塘篩選到1株地衣芽孢桿菌DSY002-2011，對(duì)其飼料蛋白質(zhì)、淀粉的降解特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該菌株在水溫28 ℃、pH值為7的1%飼料培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，對(duì)飼料蛋白質(zhì)、淀粉的降解率分別達(dá)到588%、62.9%，說(shuō)明在養(yǎng)殖水體中添加地衣芽孢桿菌對(duì)水體殘余餌料的降解是非常有效的。有研究報(bào)道，地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種具有重要生物活性的胞外產(chǎn)物，如肽類或非肽類的抗菌物、小分子活性物質(zhì)及多種胞外消化酶[10]，因此它可促進(jìn)養(yǎng)殖水體的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)，從而凈化水質(zhì)[11-13]。

在實(shí)際應(yīng)用中，地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶能力及胞外產(chǎn)物的活性均會(huì)受到水質(zhì)環(huán)境因子的影響[14]，如溫度、鹽度和pH值等除了影響菌株的生長(zhǎng)，也會(huì)影響菌株的酶系活性[15]，從而影響菌株對(duì)飼料蛋白質(zhì)、淀粉的降解能力。本試驗(yàn)中，較合適的降解條件為偏酸性至中性（pH值6～7） 、 適溫（25～30 ℃） 、低鹽濃度（0～1.0%），這與謝航等的研究結(jié)果[16]一致。朱彥博等研究表明，隨著鹽度增加，菌株相對(duì)蛋白酶的活性趨于減弱[17]，這與本研究蛋白降解率隨著鹽度增加而降低的結(jié)果一致。另外，從很多報(bào)道看，不同菌株在相同pH值條件下蛋白酶活性存在顯著差異[14，17-18]，最大酶活性出現(xiàn)在pH值7.0～10.5之間不等，這可能是因?yàn)樯婕傲瞬煌匾卵挎邨U菌菌株，說(shuō)明不同菌株的最適pH值是存在差異的，在今后工作中，要特別注意不同菌株環(huán)境因子的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊學(xué)芬，楊瑞斌，齊振雄. 微生態(tài)制劑在水質(zhì)調(diào)控中的應(yīng)用[J]. 水利漁業(yè)，2003，23（3）：40-42.

[2]王彥波，鄧岳松. 微生態(tài)制劑對(duì)蝦池水質(zhì)影響的研究[J]. 水利漁業(yè)，2003，23（2）：16-17.

[3]張 巍，趙 軍，郎咸明，等. 硝化細(xì)菌在不同溫度下對(duì)氮素的去除效能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理，2010，35（6）：83-86.

[4]丁愛(ài)中，陳繁忠，雷劍泉，等. 光合細(xì)菌調(diào)控水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)水質(zhì)的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2000，19（6）：339-341，344.

[5]尹文林，沈錦玉，沈智華，等. 枯草芽孢桿菌B115株對(duì)水質(zhì)改良效果研究[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，2006，06（6）：9-11，20.

[6]Lin Y，Kong H N，He Y L，et al. Simultaneous nitrification and denitrification in a membrane bioreactor and isolation of heterotrophic nitrifying bacteria[J]. Japanese Journal of Water Treatment Biology，2004，40（3）：105-114.

[7]馬廣慈，唐任寰，鄭斯成. 藥物分析方法與應(yīng)用[M]. 北京：科學(xué)出版社，2000：189-190.

[8]沈 萍，范秀容，李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，1999.

[9]曹煜成，李卓佳，林小濤，等. 地衣芽孢桿菌De株對(duì)凡納濱對(duì)蝦糞便的降解效果[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，29（4）：125-131.

[10]曹煜成，李卓佳，馮 娟，等. 地衣芽孢桿菌胞外產(chǎn)物消化活性的研究[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，2005，24（6）：6-12.

[11]Moriarty D J. The role of microorganisms in aquaculture ponds[J]. Aquaculture，1997，151（1）：333-349.

[12]Sahu M K，Swarnakumar N S，Sivakumar K，et al. Probiotics in aquaculture：importance and future perspectives[J]. Indian Journal of Microbiology，2008，48（3）：299-308.

[13]曹煜成，李卓佳，林黑著，等. 地衣芽孢桿菌De在優(yōu)質(zhì)草魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究[J]. 南方水產(chǎn)，2008，4（3）：15-19.

[14]曹煜成，李卓佳，吳灶和，等. 地衣芽孢桿菌胞外蛋白酶的純化及特性分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2006，30（3）：262-268.

[15]張慶華，封永輝，王 娟，等. 地衣芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體氨氮、殘餌降解特性研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（3）：498-503.

[16]謝 航，邱宏端，王秀彬，等. 地衣芽孢桿菌降解水產(chǎn)養(yǎng)殖中殘余餌料的特性研究[J]. 福建水產(chǎn)，2008，26（3）：31-35.

[17]朱彥博，唐葉玲，陳圣豐，等. 鹽度、溫度和pH對(duì)2株海南地衣芽孢桿菌相對(duì)蛋白酶活性的影響[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，31（2）：133-138.

[18]袁 鑄，王忠彥，胡 承，等. 地衣芽孢桿菌JF-UN122堿性蛋白酶的分離純化與性質(zhì)[J]. 工業(yè)微生物，2003，33（3）：25-29.