豬偽狂犬病病毒泰州株的分離鑒定

郭廣富　曹軍平　朱愛萍等

摘要：從泰州市姜堰區某豬場發生的疑似偽狂犬病病豬中采集病料，接種PK15細胞，收取細胞病毒液并提取DNA，經PCR檢測及間接免疫熒光鑒定，結果表明該分離株為豬偽狂犬病毒，命名為TAIZ130417。分離的病毒在PK15細胞上的生長滴度可以達到108.12 TCID50/mL。將該病毒接種家兔，家兔很快出現奇癢并最終死亡等偽狂犬癥狀。

關鍵詞：豬偽狂犬病毒；分離；鑒定

中圖分類號： S858.285.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0200-03

偽狂犬?。╬seudorabies，PR） 是由偽狂犬病病毒 （pseudorabies virus，PRV）引起多種家畜和野生動物以發熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病[1]。以豬的感染最為普遍，該病毒能引起母豬的繁殖障礙，主要表現為流產、死胎、木乃伊胎等；新生仔豬發生感染時，死亡率可高達100%；此外，育肥豬感染往往致使其生長緩慢，種公豬感染則導致精液品質下降甚至喪失種用價值[2]。偽狂犬病最早在美國發現，我國于20世紀40年代末在貓中首次發現了該病毒，60年代初在豬群中也出現了該病毒流行。目前，該病在我國廣泛流行，嚴重威脅著豬群的健康，并造成了養豬業嚴重的經濟損失[3-4]。本研究對泰州市某豬場疑似偽狂犬病患豬采集肝、腎及脾等組織病料，進行PRV的分離、鑒定，以期為今后深入研究和科學地防控該病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料

疑似偽狂犬病病豬的肝、腎及脾等組織，于2013年4月17日采自泰州市姜堰區某豬場。將采集的病料研碎，按 1 g ∶5 mL 加入無菌含雙抗的PBS溶液，混勻，反復凍融3次，離心取上清，用孔徑0.22 μm濾器過濾后，-20 ℃保存備用。

1.2 試劑、細胞、陽性血清及家兔

基因組DNA快速抽提試劑盒（動物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）購自Fermentas公司。PK15細胞由江蘇省動物流行病學研究中心保存。豬源抗PRV陽性血清，購自VMRD公司，羊抗豬IgG-FITC，購自SANTN CRUZ公司。胰酶細胞消化液，購自上海碧云天生物技術有限公司；新生牛血清和DMEM培養基購自上海生工生物工程有限公司。健康的家兔4只，購自江蘇農牧科技職業學院農場。

1.3 引物的設計與合成

根據文獻[5]方法，合成1對PRV引物，片段針對PRV gH基因中的一段序列，擴增片段長355 bp。引物序列為：上游引物5′-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3′；下游引物 5′-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及PCR

用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用50 μL反應體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結果。

1.5 病毒的分離

將上述“1.1”節處理的經PCR檢測呈PRV陽性的病料懸液接種于PK15單層細胞上，37 ℃孵育1 h后棄接種液，加入含2%新生牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養箱，每日觀察，盲傳至細胞病變穩定、病變率達80%時收毒，對收獲的病毒液PCR檢測PRV。

1.6 病毒的IFA鑒定

將分離毒接種至長滿單層的PK15細胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h；同時以未接種病毒的PK15細胞作為陰性對照。待檢細胞使用PBS洗滌3次，冰甲醇4 ℃固定 30 min；PBS洗滌3次，加入豬源抗PRV陽性血清，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，再加入FITC標記的羊抗豬抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，置于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 病毒滴度測定

將病毒液稀釋成10-1～10-10，分別接種到96孔培養板中長成融合單層的PK15細胞上，每個稀釋度接種8孔，培養板最后2列孔接種稀釋液作對照，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，96 h后觀察細胞病變，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.8 家兔接種試驗

用PRV分離毒株腹側皮下接種2只家兔，2 mL/只；另取2只作為陰性對照組，分別注射細胞維持液，2 mL/只。試驗組和對照組隔離飼養，每日觀察記錄家兔的臨床表現。

2 結果與分析

2.1 病料的PCR檢測

對疑似PRV感染豬組織病料提取DNA，然后進行PCR檢測，擴增出片段大小為355 bp的目的條帶，與預期結果相符（圖1）。

2.4 病毒滴度

統計不同稀釋度的分離毒在96孔細胞板上PK15細胞中出現的致細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench法測得分離毒滴度可達108.12 TCID50/mL。

2.5 家兔感染試驗

2只試驗組家兔在接種細胞病毒液后約48 h表現奇癢癥狀，不斷啃咬腹側注射部位，掉毛出血；接種后62 h時出現角弓反張而死亡。注射細胞維持液的對照組家兔觀察7 d后均無異常表現。死亡兔剖檢可見腦膜充血、肺瘀血，并有大小不等的出血斑點，氣管環充、出血，肝瘀血腫大、有壞死灶等（圖4）。

3 結論與討論

PR是危害養豬業的重要傳染病[6]，我國是一個養豬大國，因而對該病病原的深入研究具有非常重要的意義。

PCR技術是從分子水平對病毒進行診斷的一種方法，能檢出痕量病毒。PCR具有快速、敏感、特異性強等優點，不僅可以檢測細胞培養的PRV，而且可以直接檢測臨床樣品[7]。本試驗先對臨床PR可疑病豬采集病料進行PCR檢測，檢測陽性后才接種到細胞，提高了細胞分離的成功率。

PRV具有泛嗜性，能在許多細胞中增殖。豬的PK-15、SK6、PS細胞，倉鼠的BHK-21，猴的Vero細胞、GMK細胞和兔的EP細胞等都能用于增殖該細胞，其中PRV對豬腎細胞和兔腎細胞最為敏感，生產上常使用豬細胞系PK-15或 SK-16 細胞進行PRV的培養。本試驗選用PK-15細胞分離培養，除了PRV對其具有較強的敏感性外，該細胞還具有易培養、增殖速度快等特點[8]。

IFA是我國目前用于PR快速診斷的一種較好方法，該方法具有特異性高，不與細小病毒、腺病毒、血凝性腦炎病毒及腸道病毒發生交叉反應，以及敏感性較高等特點[9]。對本次細胞病毒的鑒定采用了IFA方法，發現分離病毒感染PK15后呈現明顯的特異性綠色熒光，而未接種PRV的PK15細胞沒有觀察到任何特異性熒光。

動物接種試驗是PR常用的檢測方法。將病料或分離的病毒上清液皮下接種到家兔或小鼠，根據家兔或小鼠的臨床癥狀做出判定。若接種液中含有PRV，家兔會不?？幸Ы臃N部位，隨即后肢麻痹，臥地不起，最后抽搐死亡；小鼠接種含有PRV的病料，也會出現神經癥狀，最后死亡。本試驗使用學校牧場飼養的健康家兔，接種細胞毒后3 d內發病死亡，觀察到典型的神經癥狀，且解剖見到明顯的內臟病理變化。

本試驗將PCR檢測后PRV陽性的病料接種PK15細胞，經IFA鑒定、病毒滴度測定及家兔接種試驗，結果成功分離出一泰州株PRV。該毒株的獲得，為今后深入研究該病毒的分子生物學特性及開發有效的免疫制劑提供了科學的參考依據。

參考文獻：

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