白花三葉草對3種草坪草種子萌發、幼苗生長的化感作用

劉威　宣亞楠　袁曉婷等

摘要：研究不同濃度白花三葉草（Trifolium repense L.）水浸液對草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草3種禾本科草坪草種子萌發、幼苗生長以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等保護酶活性和丙二醛含量的影響。結果表明，白花三葉草水浸液對3種草坪草種子發芽率、發芽勢、幼苗苗高均表現出低濃度促進、高濃度抑制的作用趨勢；對幼苗根長均有不同程度的抑制作用，水浸液濃度越高，抑制作用基本上也越強；對種子發芽指數、幼苗鮮質量的影響則因草坪草種類的不同而不同。在不同濃度的白花三葉草水浸液處理下，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性呈現“低濃度上升、高濃度下降”的趨勢，POD、APX活性和丙二醛含量則不同程度地升高。

關鍵詞：白花三葉草；草坪草；化感作用；種子萌發；幼苗生長

中圖分類號： Q945.79 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0171-04

白花三葉草（Trifolium repense L.）為豆科車軸草屬多年生草本植物，喜陽耐陰，具有適應性廣、抗熱抗寒性強、生長迅速、綠期長等優點，在世界各地作為優良草坪草廣泛栽植。近年來，我國北方寒冷地區為了改善城市中草坪的適應性并延長其綠期，人們常將白花三葉草與冷季型禾本科草坪草混合建植草坪[1-2]。研究表明，白花三葉草會侵占禾本科草坪，在禾本科草坪上形成小群落，影響原有的景觀效果[1]。白花三葉草入侵禾本科草坪過程中，化感作用（allelopathy）被認為是一個重要因素[3-6]。植物的化感作用是植物通過莖葉揮發、雨水淋溶、根系分泌、殘體分解等途徑向環境中釋放化感物質（allelochemicals），從而對其他植物或自身的生長發育產生促進或抑制作用[6-7]。化感作用廣泛存在于自然界中，是生態系統中自然的化學調控現象以及植物適應環境的一種機制。開展化感作用研究對于生態系統中植被形成及演替、植物生長發育調控具有重要意義[8]。研究表明，植物通過化感作用造成細胞傷害進而影響自身或其他植物生長發育過程中，植物細胞內活性氧自由基代謝失衡進而引起自由基積累以及膜脂過氧化，導致膜系統結構、功能受到損傷是重要原因之一[9-11]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等酶類是植物細胞在長期進化過程中形成的防御活性氧自由基毒害的保護酶系統，以維持植物體內活性氧自由基代謝的動態平衡[11-12]。目前，關于白花三葉草對冷季型草坪草化感作用研究主要集中在植株水浸液、揮發物、根系分泌物、腐解液等對受體植物種子萌發、幼苗生長的影響。研究表明，雨水淋溶是植物活體、殘體釋放化感物質的主要途徑之一[13]。本研究以我國北方寒冷地區草坪建植中經常使用的3種冷季型禾本科草坪草即草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草為材料，用蒸餾水浸提白花三葉草植株模擬自然雨水淋溶過程，研究不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草種子萌發、幼苗生長、SOD等保護酶活性以及丙二醛（MDA）含量的影響，旨在為進一步研究白花三葉草侵占禾本科草坪的原因提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮的生長良好的白花三葉草全株采自東北農業大學校園內。受體植物草地早熟禾（Poa pratensis L.）、高羊茅（Festuca arundinaces Schreb.）、多年生黑麥草（Lolium perenne L.）種子均購自江蘇圣園種子培育基地。

1.2 方法

1.2.1 白花三葉草水浸液的制備

將白花三葉草全株去除雜質，用蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干水分。取白花三葉草全株25 g，用剪刀剪成長1～2 cm的小段，倒入三角瓶中，加入 250 mL 蒸餾水浸泡48 h（每隔12 h用玻璃棒攪動1次），用布氏漏斗過濾，得到0.100 g/mL白花三葉草水浸液。用蒸餾水稀釋該水浸液，分別獲得0.005、0.025 g/mL水浸液，4 ℃保存備用。

1.2.2 草坪草種子萌發試驗

采用培養皿濾紙法進行種子萌發試驗。首先用0.1%HgCl2溶液對3種草坪草種子消毒10 min，用自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗2～3次。分別選擇大小均一、籽粒飽滿的3種草坪草受體種子各100粒，用消毒過的鑷子將其均勻放置于鋪有2層濾紙的培養皿中，分別加入不同濃度（0.005、0.025、0.100 g/mL）的白花三葉草水浸液10 mL，以蒸餾水為對照（CK），每處理重復3次。試驗期內適量補充蒸餾水以保持培養皿內濾紙濕潤。將加有受體種子的培養皿放入人工氣候箱中，于25 ℃進行培養，每隔 24 h 觀察并記錄萌發種子數（胚根或胚軸突破種皮1～2 mm為萌發）。3 d后計算發芽勢（GE），7 d后計算發芽率（GR）、發芽勢、發芽指數（GI）[6]。7 d后從每個培養皿隨機挑選10株草坪草幼苗，用吸水紙吸干水分，用電子天平稱量鮮質量，用直尺測量苗高、根長。各指標計算公式如下：

式中：IR為抑制率，%；C為對照值，T為處理值；當IR>0時，表示抑制作用；當IR<0時，表示促進作用。IR絕對值大小代表化感作用強弱[6]。

1.2.3 保護酶活性、丙二醛含量的測定

7 d后從每個培養皿隨機挑選若干株草坪草幼苗，用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干水分，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱內保存待用。采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）法[14]測定SOD活性，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位。采用過氧化氫還原法[14]測定CAT活性，以1 min 240 nm處吸光度減少0.01定義為1個活性單位。采用愈創木酚法[14]測定POD活性，將1min 470 nm處吸光度增加0.01定義為1個活力單位。參照陳建勛等的方法[15]測定APX活性，以1 min 290 nm處吸光度降低0.01定義為1個酶活性單位。采用硫代巴比妥酸法[14]測定丙二醛含量，每個指標均重復測定3次。

1.3 數據處理

采用Excel 2007、SPSS 12.0軟件處理數據，用Duncans方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 白花三葉草水浸液對草坪草種子萌發的影響

從表1可以看出，不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草種子的發芽率均表現為“低促高抑”的雙重作用。與對照相比，0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理下，草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草種子的發芽率均提高，但差異均不顯著；隨著白花三葉草水浸液濃度的增加，對3種草坪草種子的發芽率抑制率提高，0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理的抑制作用最強。

不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草種子的發芽勢亦表現為“低促高抑”的雙重作用。0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理的促進作用最強，0.005 g/mL白花三葉草水浸液處理下，高羊茅、多年生黑麥草發芽勢與對照相比差異顯著（P<0.05）。當白花三葉草水浸液濃度≥0.025 g/mL時，對3種草坪草的發芽勢整體呈抑制作用，且水浸液濃度越高，抑制作用越強。不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草種子的發芽指數影響不同，但在高濃度下均呈抑制作用，明顯延緩了草坪草種子的發芽進程。不同濃度白花三葉草水浸液對草地早熟禾、高羊茅的發芽指數均表現為“低促高抑”的雙重作用，0005 g/mL白花三葉草水浸液處理提高了2種草坪草的發芽指數，但只有高羊茅處理與對照相比差異顯著（P<005）。與對照相比，0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理顯著降低了草地早熟禾、高羊茅的發芽指數。不同濃度白花三葉草水浸液均對多年生黑麥草的發芽指數產生抑制作用，隨著水浸液濃度的增加，抑制作用增強。

2.2 白花三葉草水浸液對草坪草幼苗生長的影響

從表2可以看出，不同濃度白花三葉草水浸液對草坪草幼苗苗高整體表現為“低促高抑”的雙重作用（除多年生黑麥草）。0.005 g/mL 白花三葉草水浸液處理對3種草坪草幼苗苗高的促進作用不明顯，與對照相比均無顯著差異。隨著白花三葉草水浸液濃度的增加， 對3種草坪草苗高的抑制作用愈加明顯。

不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗根長均有不同程度的抑制作用，基本表現為白花三葉草水浸液濃度越高，抑制作用越強。0.100 g/mL白花三葉草水浸液處理對草地早熟禾、高羊茅根長的抑制作用最強，與對照相比差異顯著（P<0.05）。0.025 g/mL白花三葉草水浸液處理對多年生黑麥草根長的抑制作用最強。不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗鮮質量的影響因草坪草種類的不同而不同。白花三葉草水浸液對草地早熟禾的鮮質量表現為強烈的促進作用。不同濃度白花三葉草水浸液對高羊茅、多年生黑麥草鮮質量整體表現為“低促高抑”的作用趨勢。

2.3 不同濃度白花三葉草水浸液對草坪草幼苗保護酶活性、丙二醛含量的影響

由表3可知，不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保護酶的活性及丙二醛含量均產生明顯的影響，但影響趨勢不同。

不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均表現出低濃度促進、高濃度抑制的作用趨勢。當白花三葉草水浸液濃度為0.005 g/mL時，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均高于對照，但差異不顯著。當白花三葉草水浸液濃度≥0.025 g/mL時，3種草坪草幼苗SOD、CAT活性均受到明顯抑制，且抑制作用隨著水浸液濃度的增加而增強。不同濃度白花三葉草水浸液均不同程度提高了3種草坪草幼苗POD、APX活性以及丙二醛含量。各處理下3種草坪草幼苗APX活性與對照相比均顯著提高（P<0.05）。低濃度白花三葉草水浸液（0.025 g/mL）處理提高3種草坪草幼苗丙二醛含量的作用不明顯。當白花三葉草水浸液濃度 ≥0.025 g/mL 時，除多年生黑麥草0.025 g/mL處理外，其他處理下3種草坪草幼苗丙二醛含量與對照相比均顯著提高（P<0.05）。

3 結論與討論

白花三葉草原產于歐洲、北非，作為優質牧草在全世界范圍內廣泛栽植。近年來，在我國北方寒冷地區，白花三葉草常與冷季型禾本科草坪草混合栽培應用。白花三葉草植株低矮，根系發達，主莖短，莖節上長出匍匐莖，莖節向下產生不定根，根部具有較強的分蘗能力、再生能力，成坪迅速，具有很強的侵占性。研究表明，同其他草坪草競爭光照、水肥等是白花三葉草侵占禾本科草坪的原因之一[16]。白花三葉草能夠通過釋放化感物質來抑制禾本科草生長，從而形成單一群落或者侵入禾本科草草坪[2-6]。本研究以白花三葉草為材料，用蒸餾水浸提白花三葉草植株模擬自然雨水淋溶過程，采用生物測定法研究不同濃度白花三葉草水浸液對草地早熟禾、高羊茅、多年生黑麥草3種常見冷季型草坪草種子萌發、幼苗生長的影響，并對不同處理下3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX等保護酶活性以及丙二醛含量進行了測定。結果表明，白花三葉草水浸液對3種草坪草的種子萌發、幼苗生長均產生不同程度的影響，SOD等保護酶的活性以及丙二醛含量均發生不同程度的變化，由此可知白花三葉草對草坪草具有化感作用，可以通過雨水淋溶釋放化感物質影響草坪草的生長。不同濃度的白花三葉草水浸液對3種草坪草的種子發芽率、發芽勢、幼苗苗高均表現出低濃度促進、高濃度抑制的雙重作用。不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草種子發芽指數影響不同，但在高濃度下（≥0.025 g/mL）均表現為抑制作用，明顯延緩了草坪草種子的發芽進程。不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗根長均有不同程度的抑制作用，水浸液濃度越高，抑制作用越強。不同濃度白花三葉草水浸液對3種草坪草幼苗鮮質量的影響因草坪草種類不同而不同，這可能與種子體內物質的種類、濃度及轉化途徑不同有關[6]。研究表明，化感物質對受體植物生長發育的化感作用機制是通過影響其細胞生長分化實現的[17-18]。Cruz等認為，化感物質破壞細胞膜的功能也是對受體植物產生化感抑制作用的機制之一[19]。SOD等植物保護酶系統具有清除活性氧自由基、減輕膜脂過氧化程度等作用。本研究表明，與對照相比，低濃度白花三葉草水浸液處理（0.005 g/mL）增加了3種草坪草幼苗SOD、CAT、POD、APX活性，說明3種草坪草幼苗自身能夠通過某些調節機制，提高SOD、CAT、POD、APX活性以減輕膜脂過氧化程度。隨著白花三葉草水浸液濃度的增加，植物受傷害程度加大，SOD、CAT活性逐漸下降，POD、APX活性仍然維持在較高水平。這與劉迎等研究白花三葉草對苘麻、稗草的化感作用[10]以及張來等研究白花三葉草提取液對白菜等3種植物種子萌發、幼苗生長的影響結果一致[13]。MDA 作為膜脂過氧化的最終產物，其累積量會隨著細胞傷害程度的加劇而不斷增大[20]。在不同濃度的白花三葉草水浸液處理下，3種草坪草幼苗中丙二醛含量均高于對照，說明發生了膜脂過氧化反應，致使細胞膜系統遭到了破壞。研究證實，植物體內化感物質的種類、濃度、相互作用顯著影響其對受體植物的化感作用，酚類物質是重要的水溶性化感物質之一[21-22]。白花三葉草水浸液中含有多種酚類物質，酚類物質在不同濃度的白花三葉草水浸液中含量不同，會產生不同的協同或拮抗作用[18]。此外，草地早熟禾等3種草坪草具有不同的生物特性，因此在感受不同濃度的白花三葉草水浸液的化感作用時，并未表現出整齊一致的作用規律[6]。

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