5種長白山有毒真菌提取液的抑菌殺蟲活性

王豐　范余娟

摘要：以5種長白山有毒真菌為原料，對其活性成分的提取工藝進行初步研究，并對提取液的抑菌作用及其對榆綠毛螢葉甲、蚜蟲的殺蟲活性進行研究。結果表明，提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明顯；提取液對榆綠毛螢葉甲、蚜蟲的致死效果從強到弱依次為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑。

關鍵詞：長白山；有毒真菌；提取液；生物活性；抑菌效果

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0126-04

生物源農藥因具有對人、畜安全，不污染環境，不易引起抗藥性，在自然環境中易降解等特點，已引起國內外學者高度重視，并成為當今農藥研究的熱點[1]。研究發現，一些大型真菌的子實體從來不被昆蟲侵襲，受傷后的子實體及其發酵培養物中可以產生具有抗真菌、殺蟲等多種活性的次生代謝產物[2-3]。通過對一些大型有毒真菌的子實體或代謝產物進行抗蟲活性試驗發現，大型有毒真菌中含有的多種抗蟲活性物質如毒蠅堿、毒肽、毒傘肽等可以直接用于毒殺害蟲，也可以作為生物源農藥研究和開發的材料。目前利用大型真菌提取物在黏蟲、桃潛葉蛾、棉鈴蟲、小菜蛾的拒食和毒殺活性方面的研究已有報道，但是在蚜蟲、榆綠毛螢葉甲方面的研究報道較少，筆者用85%乙醇提取長白山有毒真菌的有效成分，并對其生物活性進行研究，旨在為充分開發利用該植物資源奠定基礎，并為有毒真菌的高效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉、米根霉、黑曲霉、酵母（由吉林農業科技學院實驗室提供）；有毒真菌：紅柄牛肝菌、紅菇、毛頭乳菇、皂味口蘑、鵝膏菌（采集于白山市八道江鎮長白山原始林區）。

試驗儀器：722型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、電子恒溫水浴鍋、高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

主要試劑有乙醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、牛肉膏、蛋白胨等，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 真菌提取液的制備 將采集于白山市八道江鎮長白山原始林區的野生有毒真菌在室溫下避光晾干后粉碎成粗粉，通過單因素試驗和正交試驗（表1、表2），找到超聲輔助乙醇提取的最佳工藝條件[4-5]。

確定最佳條件為A1B2C2D2，即料液比為1 g ∶30 mL、提取時間為30 min、提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為85%，在此條件下制備真菌提取液備用。

1.2.2 真菌提取液的抑菌性測定 采用濾紙片法測定真菌提取液的抑菌性：在牛肉膏蛋白胨培養基平板上分別涂布02 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌懸液，在PDH培養基平板上分別涂布0.2 mL米根霉、青霉、酵母、黑曲霉懸液；然后將滅過菌的濾紙片浸在提取液中，放入培養皿中，細菌指示菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌）于30 ℃培養，霉菌指示菌（米根霉、青霉、酵母、黑曲霉）于 35 ℃ 培養，做3～4個平行，細菌置于30 ℃培養箱中培養 24 h，霉菌置于35 ℃培養箱中培養24 h后，測量濾紙片抑菌圈直徑大小，抑菌圈越大，表明抑菌效果越好。

1.2.3 真菌提取液對榆綠毛螢葉甲的殺蟲活性測定 榆綠毛螢葉甲的浸漬法（即喂毒和觸殺法）處理：將榆綠毛螢葉甲采集到干燥的塑料瓶中備用，共采樣18份。預先準備18個純凈的塑料瓶，用剪刀將瓶口剪大，剪取18片足夠包裹住瓶口的紗布，并分別在紗布上做記號，另外準備18根皮套及若干棉花團、棉花片備用。每種粗提液做3組對照，將5種粗提液分別倒入5個小燒杯中，分別浸泡榆綠毛螢葉甲5 s，將浸泡后的榆綠毛螢葉甲分別放置在18個純凈的塑料瓶中，在瓶中放入一小團稍微捏干（水不會流出）的濕棉花，且在每個瓶子中放入2張榆樹葉，將棉花片浸濕后稍微捏干放置在瓶口，一半遮蓋一半敞開，然后用紗布包裹住瓶口，再用皮套系牢，防止蟲子從瓶中跑出。以清水作對照，所有步驟處理好后，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.4 真菌提取液對蚜蟲的殺蟲活性測定 蚜蟲的浸漬法（即喂毒和觸殺法）處理：采集帶蚜蟲的葉片（帶莖），將大蟲用挑針剔除，在培養皿中裝一半沙子，加水浸濕后將水倒出，在培養皿上蓋1層培養皿口大小的報紙，其上挖1個小洞（每種粗提液做3組，1組培養24 h，另一組培養48 h，共需準備36個這樣的培養皿，分別做好標記），準備好待用。將5種粗提液分別倒入5個小燒杯中，分別浸泡蚜蟲5 s；另以清水作對照。將處理好的帶蚜蟲葉的莖插入到待用培養皿上報紙的小洞中，有蚜蟲的一端朝上。所有步驟處理好后，置于25 ℃的恒溫培養箱中培養。

2 結果與分析

2.1 有毒真菌提取物對榆綠毛螢葉甲的作用

將按“1.2.3”節步驟處理的榆綠毛螢葉甲培養24 h后，打開紗布，查看并統計蟲的死亡數（用鑷子輕輕碰觸，腿會動彈的為活蟲，反之為死蟲），結果見表3。

從表3、表4可以看出，經浸漬法處理24、48 h后的榆綠毛螢葉甲在清水中全部存活，而在紅柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，紅菇次之，乳菇再次之，且在這3種溶液中的死亡率都達到了70%以上，說明這3種溶液對榆綠毛螢葉甲有強的致死作用，在皂味口蘑和鵝膏菌溶液中的死亡率均為40%左右，說明它們對榆綠毛螢葉甲致死作用相對較弱。

從表5、表6中可以看出，有毒真菌原液稀釋10倍后的致死效果仍是紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，但榆綠毛螢葉甲的死亡率降低將近一半，總的來說，還是有致死效果的。

由表7、表8、表9可以看出，有毒真菌原液稀釋20倍的死亡率為0，但將榆綠毛螢葉甲浸泡在稀釋后的粗提液中5 s后，榆綠毛螢葉甲的動態不同，活潑榆綠毛螢葉甲的數量排序為清水>皂味口蘑>鵝膏菌>毛頭乳菇>紅菇>紅柄牛肝菌，說明毒性順序依次增強；同時發現，在清水中的榆綠毛螢葉甲異常活潑（在瓶子中上下爬行），在紅柄牛肝菌稀釋液中的榆綠毛螢葉甲雖然沒死，但榆綠毛螢葉甲的行動能力明顯減弱，一般聚集在瓶子的底部，只有1～2頭在瓶壁緩慢爬行。

從表10、表11可以看出，經浸漬法處理24、48 h后的蚜蟲在清水中全部成活，而在紅柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，紅菇次之，乳菇再次之，且在這3種溶液中的死亡率都達到了60%以上，說明這3種溶液對蚜蟲有強的致死作用；在皂味口蘑和鵝膏菌溶液中的死亡率均在33%～42%，說明這2種溶液對其致死作用相對較弱。

從表12、表13中可以看出，有毒真菌原液稀釋10倍后的致死效果從強到弱仍是紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，但蚜蟲的死亡率降低將近一半，總的來說，還是有致死效果的。

從上述數據可以看出，致死效果為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，將原液稀釋10倍，蚜蟲的死亡率將近降低一半，而將原液稀釋20倍，蚜蟲的死亡率為0，說明在這些菌液中能致死的成分不多。

2.3 抑菌作用

提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑制效果很弱。用濃縮液對4種霉菌做抑菌性試驗，抑菌效果仍然不明顯。由此可以推斷，鵝膏菌提取液對細菌的抑制活性從強到弱依次為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，對4種霉菌抑制活性不明顯（表17）。

3 結論

本研究表明，有毒真菌提取液對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明顯；提取液對榆綠毛螢葉甲和蚜蟲的致死效果排序為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，將原液稀釋10倍，榆綠毛螢葉甲的死亡率將近降低一半；將原液稀釋20倍，蟲的死亡率為0，說明在這些菌液中能致死的成分不多。

參考文獻：

[1]李首昌，劉鳳沂，馬建華. 生物農藥的開發與應用[J]. 現代化農業，2002（7）：10-11.

[2]劉吉開. 高等真菌化學[M]. 北京：中國科學技術出版社，2004.

[3]高錦明. 高等真菌代謝產物[M]. 楊凌：西北農林科技大學出版社，2003.

[4]王 豐，趙 權. 串紅花色素的提取與穩定性研究[J]. 江蘇農業科學，2010（6）：473-475.

[5]王 豐，趙 敏，薛曉麗.杭白菊多糖超聲提取工藝的研究[J]. 北方園藝，2012（2）：28-31.