野栽滲入系水稻籽粒儲藏蛋白質含量的QTL遺傳解析

趙琳琳　李楠　呂志偉等

摘要：以云南元江普通野生稻為供體親本、以優良秈稻品種特青為受體親本構建了高代回交群體（BC3）。采用全自動凱氏定氮儀測定糙米中的總氮含量，用總氮含量乘以5.95估算儲藏的蛋白質含量，蛋白質含量采用Map Manager QTXb17軟件進行數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位分析，利用QTL檢測分析2次測定的儲存蛋白，結果共發現14個對蛋白質含量有較高相關性的QTL。在第1號染色體的RM272、RM243、RM23、RM5、RM212、RM306位點和第2號染色體的RM250位點附近發現了7個能提高蛋白質含量的QTL，它們均來源于野生稻；另外7個QTL位于第6、7、8、10號染色體上，分別是第6號染色體的RM345、第7號染色體的RM295、RM82、RM481、RM172，第8號染色體的RM25，以及第10號染色體的RM258附近的QTL，它們來源于栽培稻親本特青的等位基因作用表現為提高蛋白質含量。在檢測到的QTL中，有6個QTL在2次分析中均被檢測到，經分析是較穩定的低蛋白QTL，它們分別為RM243、RM23、RM5、RM295、RM82、RM258。

關鍵詞：野生稻基因滲入系；籽粒儲藏蛋白質；凱氏定氮法；QTL分析

中圖分類號： Q946.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0050-03

水稻是一種重要的糧食作物，世界上約50%的人口以稻米為主食，稻米蛋白質被稱作優質植物蛋白[1]，通過與其他谷物進行比較可知，水稻中必需氨基酸的含量大體上要高于聯合國糧食及農業組織（FAO）/世界衛生組織（WHO）建議的標準水平[2]，其第一限制性氨基酸賴氨酸含量高于其他谷類，是人類蛋白質的主要來源之一。在發展中國家，約60%的蛋白來源于谷物，在未來的幾十年里，谷物仍是世界上2/3人口的主要蛋白來源[3]。因此，提高稻米蛋白質含量已經成為當今水稻品質育種的一個重要內容；同時，隨著慢性腎功能不全患者不斷增加，培育低蛋白含量，特別是培育低可消化吸收蛋白（谷蛋白）含量水稻品種已成為功能水稻的新育種目標。

籽粒儲存蛋白受多基因控制，屬于數量遺傳性狀，開展控制籽粒儲存蛋白含量的數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位與克隆，不僅對水稻種質資源創新和高蛋白米、低蛋白米的新品種選育有重要的理論意義，而且對當前調整農業結構、保持農業可持續發展同樣具有重要的現實意義。

迄今為止，大量的研究主要是對水稻農藝性狀的遺傳分析和基因定位，并且對稻米品質性狀的遺傳分析和基因定位研究主要集中于加工品質、外觀品質和蒸煮及食味品質等性狀上[4-9]，而關于水稻糙米儲存蛋白定位的報道并不多見，僅限于個別報道。于永紅等利用協青早B/密陽46的重組自交系群體對水稻糙米蛋白質含量的QTL分析表明，5個控制蛋白質含量的QTLs（qPc-3、qPc-4、qPc-5、qPc-6、qPc-10）均被檢測到，單個QTL對群體表型變異的貢獻率為4.17%～19.14%；其中第6號染色體的Wx基因區域對蛋白質含量具有主效作用[10]。Li等利用亞洲栽培稻和非洲栽培稻的回交高代群體，在第8號染色體上定位到了1個QTL[11]。Yoshida等利用DH群體（由花藥單倍體誘導得到）定位到了分別位于第 8、9、11、12號染色體上的4個控制稻米蛋白含量的QTLs，其中第11號染色體RM206位點附近的QTL效應較大[12]。Aluko等利用非洲野生稻與秈稻BC3F1回交構建的DH群體，分別在第1、2、6、11號染色體上檢測到4個與蛋白質含量相關的QTLs，其中位于第1號染色體RM226至RM297位點之間的QTL貢獻率較大[13]。張濤等檢測到6個QTLs （qPc-3、qPc-6、qPc-7、qPc-8-1、qPc-8-2、qPc-11）對糙米蛋白質含量進行控制，它們分別位于第3、6、7、8、11號染色體上，單個QTL對群體表型變異的貢獻率為379%～19.41%[14]。在這些QTL的區間中，第8染色體的基因區域對糙米蛋白質含量具有主效作用。李晨等利用BC4群體共定位到了6個糙米蛋白QTLs，分別位于第1、2、8、9號染色體上，其中位于第1號染色體RM472位點附近的QTL具有主效作用[15]。

野生稻中蘊含著豐富的遺傳信息，是栽培稻的祖先，因此發掘野生稻中的有益基因不僅有利于解決當前育種資源狹窄的現狀，而且是突破育種瓶頸的有效方法之一。但是，目前關于從野生稻中定位QTL的報道并不多，各個方面都待完善，因此今后需要進一步強化這方面的工作。本研究通過采用凱氏定氮法對野生稻染色體片段代換系（簡稱水稻野栽滲入系）的籽粒儲存蛋白質含量進行分析，并對控制籽粒儲存蛋白質含量的QTL進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 群體構建

本研究所構建的野栽滲入系由中國農業大學孫傳清博士提供，是以元江普野為供體親本、秈稻品種特青為受體親本培育而成的。在BC3F2群體的基礎上，連續自交3次得到BC3F3、BC3F4群體。根據BC3F2株系表型鑒定和基因分析結果，滲入系構建的基本材料選取了263個BC3F3、BC3F4單株，最終滲入系由106個BC3F3、BC3F4候選單株構成。

1.2 SSR引物擴增及數據處理

根據Temnykh等發表的水稻SSR序列合成引物，用在親本間有多態性的112個SSR標記，調查上述野栽滲入系群體106個系的基因型[16]。在基因型分析中，“B”表示與親本特青帶型相同，“A”表示與野生稻親本帶型相同，“H”則表示具雜合帶型，“-”表示帶型模糊或由于某種原因缺失。采用MAPMAKER/EXP3.0軟件并參考Temnykh等發表的水稻SSR連鎖圖譜為框架，構建連鎖圖譜，可見112個SSR標記分布于12條染色體上，各染色體上最多的有13個標記，最少的有7個標記，平均每條染色體有9.3個標記，標記平均間距17.8 cM，基本能滿足QTL定位需要[16]。

1.3 糙米儲藏蛋白質含量的測定及QTL分析

選用2006年于北京采收的種子，挑選表型一致（如大小、顏色）的水稻籽粒，剝去穎殼后于干燥箱（105 ℃）中干燥5 h，然后以8粒種子為1組稱質量，每個家系重復5次。采用意大利產全自動凱氏定氮儀（UDK 142）測定糙米中的總氮含量，用總氮含量乘以5.95估算儲藏的蛋白質含量[17-18]。為了確保測定結果的準確性，同時選用2007年采收于北京的種子進行同樣的測定，重復3次。

采用Map Manager QTXb17軟件，取P<0.05作為判斷QTL存在的閾值，并用單位點分析法對籽粒儲藏蛋白質含量進行QTL定位與遺傳分析[19]。

2 結果與分析

2.1 籽粒儲藏蛋白質含量的分布

圖1是不同家系的蛋白質含量分布情況。可見滲入系群體的蛋白質含量趨于正態分布，符合數量性狀的特征，適于QTL定位分析。

2.2 QTL解析

將滲入系群體的籽粒蛋白質含量數據采用Map Manager QTXb17軟件進行QTL定位分析，共檢測到11個與蛋白質含量相關的QTL（表1）。其中位于第1號染色體RM272、RM243、RM23、RM5、RM306位點附近以及位于第2號染色體RM250位點附近的計6個QTL，貢獻率分別為5%、8%、6%、7%、5%、6%，加性效應分別為-0.61%、-0.91%、-0.56%、-0.57%、-0.62%、-0.69%，來源于野生稻的等位基因能夠提高糙米籽粒儲藏蛋白質含量。另外5個QTL位于第6、7、10號染色體上，分別是第6號染色體RM345位點，第7染色體RM295、RM481、RM82位點，以及第10染色體RM258位點附近的QTL，貢獻率分別為5%、9%、6%、7%、5%，加性效應值分別為084%、0.77%、0.58%、0.59%、047%，來源于特青的等位基因表現為提高糙米籽粒儲藏蛋白質含量。

2007年批次種子的重復試驗結果見表2，共檢測到9個與蛋白質含量相關的QTL。分別位于第1、7、8、10號染色體上，貢獻率為5%～10%。與表1相比可知，在第2、6號染色體上沒有檢測到QTL，而在第8號染色體上檢測到的來源于特青的、提高蛋白質含量的QTL在第1次的結果中并沒有檢測到。

2次結果均檢測到的QTL位點見表3，可見有位于第1號染色體的RM243、RM23、RM5位點附近的3個QTL，表現為野生稻等位基因提高糙米籽粒儲藏蛋白質含量；還有位于第7號染色體RM295、RM82位點和第10號染色體RM258位點附近的3個QTL，表現為特青等位基因提高糙米籽粒儲藏蛋白質含量。

3 結論與討論

本研究以元江普野為供體親本、秈稻品種特青為受體親本構建的野栽滲入系群體的種子為材料，在全自動凱氏定氮儀中消化并測定剝掉穎殼后糙米的含氮量，用含氮量乘以595作為糙米蛋白質含量的計算指標。用Map Manager QTXb17軟件，取P<0.05作為判斷QTL存在的閾值，并用單位點分析法，對籽粒儲藏蛋白質含量進行QTL定位與遺傳分析，2次共定位到14個QTL位點。其中來自野生稻親本的高蛋白QTL有7個，分別分布于第1、2號染色體上，第1號染色體上有6個，第2號染色體上有1個。來源于栽培稻親本特青的高蛋白QTL也有7個，分別分布于第6、7、8、10號染色體上，第7號染色體上有4個，其余染色體上各有1個。

通過與以前的研究結果相比較，我們發現有5 個QTL位點與前人所報道的QTL位點在同一區域或者在相臨區域。位于第1號染色體上RM23位點附近的QTL與李晨等報道的qCP1-1[15]在同一區域。位于第1號染色體上RM212位點附近的QTL，以及位于第2號染色體上RM250位點附近的QTL分別與Aluko等報道的Pro1、Pro2[13]在同一區域。位于第7號染色體RM172位點附近的QTL與吳長明等報道的Pr3[20]處于相臨區域。位于第8號染色體RM25位點附件的QTL與張濤等報道的qPc-8-2[14]在相近區域，經分析是同一位點。

此外，經過分析有9個QTL位點與以前報道的位置不一樣，是檢測到的新QTL；這9個QTL位點分別位于第1號染色體RM272、RM243、RM5、RM306位點附近，第6號染色體RM345位點附近，第7號染色體RM295、RM481、RM82位點附近，以及位于第10號染色體RM258位點附近。

在本研究中，沒有檢測到主效QTL，檢測到的QTL貢獻率最大的為10%，這一結論與Li等的研究結果[11，21-22]類似，而與于永紅等的研究結果[10，12-15，23]有所差異，認為這種差異可能是由于所用的材料不同造成的。

本研究共從野生稻中檢測到7個控制籽粒儲存蛋白質的QTL，其中在第1號染色體上有6個，在第2號染色體上有1個，這為今后進一步研究分析和利用這些QTL打下了基礎。

參考文獻：

[1]周麗慧，劉巧泉，張昌泉，等. 水稻種子蛋白質含量及組分在品種間的變異與分布[J]. 作物學報，2009，35（5）：884-891.

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[3]姚惠源. 稻米深加工[M]. 北京：化學工業出版社，2004.

[4]Tan Y F，Li J X，Yu S B，et al. The three important traits for cooking and eating quality of rice grains are controlled by a single locus in an elite rice hybrid，Shanyou 63[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，99（3/4）：642-648.