HPLC法測定寧夏紅蔥中槲皮素與山奈酚的含量

劉慧燕，方海田，張光弟，史　娟，張永健（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

HPLC法測定寧夏紅蔥中槲皮素與山奈酚的含量

劉慧燕，方海田*，張光弟，史娟，張永健
（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

摘要：以寧夏同心紅蔥、鹽池紅蔥以及市售白蔥為材料，采用甲醇+超聲波提取法對(duì)樣品中的槲皮素與山奈酚進(jìn)行了提取，并根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳提取條件。用高效液相色譜法，以保留時(shí)間定性、外標(biāo)法定量，研究蔥樣中槲皮素和山奈酚的含量，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并比較分析了兩個(gè)地區(qū)紅蔥與市售白蔥中的槲皮素和山奈酚含量差異。結(jié)果表明，方差分析可知槲皮素與山奈酚的最佳提取條件為：超聲溫度為60℃、時(shí)間為50 min、甲醇濃度為75%；最佳色譜條件為：色譜柱XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲醇0.5%冰醋酸（30∶70），流速1.0 mL/min，檢測波長為290 nm。通過比較分析可知，紅蔥中槲皮素與山奈酚含量均明顯高于市售白蔥，而鹽池紅蔥中槲皮素與山奈酚含量也均明顯高于同心紅蔥。

關(guān)鍵詞：寧夏紅蔥；槲皮素；山奈酚；提取；測定

紅蔥（學(xué)名：Allium cepa var.proliferum）是百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）洋蔥的變種。在我國，紅蔥種植范圍很廣，主要分布于東北、華北、西北及西南地區(qū)，在陜西、河北、甘肅、寧夏、河南、福建、廣東等地均有種植[1]。在寧夏紅蔥種植主要分布在同心和鹽池地區(qū)，其中寧夏同心地區(qū)種植紅蔥近萬畝，鹽池也有上千畝的種植，為當(dāng)?shù)貛砹孙@著的經(jīng)濟(jì)效益。

對(duì)蔥屬植物的研究始于上世紀(jì)，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用已進(jìn)行了大量研究，分離出多種類型化合物[2]。李光富等[3]分析了蔥內(nèi)生真菌是否具有與其宿主（蔥）相同或相似生理活性成分，為蔥內(nèi)生真菌抗菌活性開發(fā)應(yīng)用做了一些研究。徐金鐘等[4]對(duì)紅蔥中的抗稻瘟霉活性成分進(jìn)行了研究。潘俊等人[5]研究了紅蔥中抑制植物病原菌活性的成分。迄今為止，只從該屬植物中分離出十幾個(gè)化合物[6]，這些化合物有萘酚類、萘酮類、蒽醌類和葡萄糖苷類[7]，它們?yōu)榧t蔥屬植物的主要活性成分。其中，山奈酚（Kaempferol）與槲皮素（Quercetin）都屬于黃酮類物質(zhì)，可作為藥品，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用[5-8]。此外還有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量等作用[9]，其含量檢測分析多采用高效液相色譜法[10-12]。槲皮素與山奈酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1、圖2所示。

圖1　槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structure of quercetin

圖2　山奈酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2　Chemical structure of kaempferol

本研究主要以寧夏同心和鹽池紅蔥為原料，通過超聲波+甲醇提取法提取紅蔥中的黃酮類物質(zhì)槲皮素與山奈酚，采用高效液相色譜法對(duì)紅蔥中的槲皮素和山奈酚進(jìn)行了定性定量分析，并與銀川市售白蔥進(jìn)行了對(duì)比分析，為充分挖掘紅蔥在保健食品和藥品開發(fā)研究方面的潛力，提升寧夏紅蔥的深加工和綜合利用水平、促進(jìn)農(nóng)民增收和脫貧致富提供技術(shù)支撐和思路。2.5 mg/mL槲皮素溶液，分別取0.4、0.5、1.0 mL，定容于10 mL容量瓶，分別得0.1、0.125、0.25 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液。稱取山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品3.8mg，溶于10 mL容量瓶，取2.5 mL，定容于10 mL容量瓶，分別得到0.38 mg/mL 和0.095 mg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2提取方法

本試驗(yàn)采用超聲波+溶劑萃取法提取蔥樣品中的有效成分。其提取流程如下：

蔥樣品→切段、凍干粉碎→超聲波輔助提取→甲醇凈提→旋轉(zhuǎn)蒸干→石油醚脫色→回收溶劑（旋轉(zhuǎn)蒸干）→粗提物→真空冷凍干燥→粗提物

在溶劑萃取中，影響得率的主要因素有超聲溫度、超聲時(shí)間和甲醇濃度等，本研究的工藝條件范圍是：溫度45℃～75℃，時(shí)間為30 min～70 min，甲醇的濃度50%～95%。采用三因素三水平正交試驗(yàn)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，最后根據(jù)凍干后的提取物和凍干蔥樣的質(zhì)量計(jì)算得率。

1.2.3色譜條件的選擇

利用 easysep1010型高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，分別采用3種流動(dòng)相甲醇-0.5%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.4%磷酸水溶液；流速為1.0 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃。比較譜圖分離情況來確定最佳流動(dòng)相，在最佳流動(dòng)相的基礎(chǔ)上調(diào)整流動(dòng)相配比，選出有機(jī)相和水相的最佳配比，最后確定最佳色譜條件。

1.2.4紅蔥與白蔥中槲皮素和山奈酚含量的測定

進(jìn)樣量20 μL，根據(jù)2.2.3的最佳色譜條件，對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和濃度做工作曲線得出回歸方程，對(duì)樣品進(jìn)行同樣操作計(jì)算出樣品的色譜峰面積，根據(jù)回歸曲線計(jì)算出樣品中槲皮素與山奈酚的濃度，從而得到紅蔥與白蔥中槲皮素與山奈酚的含量。

1　材料與方法

1.1材料

紅蔥樣品分別取自同心、鹽池二地；白蔥為銀川市售；槲皮素、山奈酚均為分析純：購自sigma公司；甲醇、冰醋酸、石油醚、磷酸均為色譜純：購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取槲皮素25 mg，定容于10 mL容量瓶中，得到

2　結(jié)果分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

采用三因素三水平正交試驗(yàn)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，根據(jù)凍干后的提取物和凍干蔥樣的質(zhì)量計(jì)算得率。結(jié)果如表1。

表1　正交試驗(yàn)表及結(jié)果Table 1　Orthogonal test and results

圖3　不同流動(dòng)相時(shí)的槲皮素與山奈酚色譜圖Fig.3　Chromatogram of quercetin and kaempferol in different mobile phase by HPLC

續(xù)表1　正交試驗(yàn)表及結(jié)果Continue table 1　Orthogonal test and results

由表1數(shù)據(jù)分析可知，因素主次順序?yàn)锳＞C＞B，優(yōu)化水平為A2B3C2，即超聲溫度（A）為60℃、超聲時(shí)間（B）50 min、甲醇濃度（C）75%。在正交試驗(yàn)中超聲波+甲醇提取最佳條件為超聲溫度為60℃、時(shí)間為50 min、甲醇濃度為75%。

2.2HPLC測定條件的確定

2.2.1流動(dòng)相成分的確定

當(dāng)選擇流動(dòng)相為：甲醇-0.2%磷酸，流速：1.0mL/min，其中甲醇為0.8 mL/min，0.2%磷酸為0.2mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃時(shí)，色譜分離效果如圖3（a）所示。當(dāng)流動(dòng)相為：甲醇-0.4%磷酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇為0.8 mL/min，0.4%磷酸為0.2 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃時(shí)，其色譜分離效果如圖3（b）所示。當(dāng)流動(dòng)相為：甲醇-0.5%冰醋酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇為0.8 mL/min，0.5%冰醋酸為0.2mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃時(shí)，其色譜分離效果如圖3 （c）所示。

比較分析可知，采用流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰醋酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇為0.8 mL/min，0.5%冰醋酸為0.2 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃時(shí)，槲皮素與山奈酚的分離效果最好，所以選擇該流動(dòng)相為最終測定時(shí)所用的流動(dòng)相。

2.2.2流動(dòng)相比例的確定

選擇采用甲醇-0.5%冰醋酸作為流動(dòng)相，對(duì)流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的最佳配比進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4 中a、b、c、d分別所示。

當(dāng)有機(jī)相與水相的比例為50∶50時(shí)，如圖4（a）中所示。當(dāng)有機(jī)相與水相的比例為60∶40時(shí)，如圖4（b）中所示。當(dāng)有機(jī)相與水相的比例為10∶90時(shí)，如圖4 （c）中所示。當(dāng)有機(jī)相與水相的比例為30∶70時(shí)，如圖4（d）中所示。對(duì)各圖譜比較分析，可以看出，在以甲醇-0.5%冰醋酸為流動(dòng)相時(shí)，當(dāng)有機(jī)相與水相比例為30∶70時(shí)，槲皮素與山奈酚的分離效果最好，故選擇該30∶70為流動(dòng)相的有機(jī)相與水相的最佳配比。結(jié)果表明，測定紅蔥中槲皮素與山奈酚含量時(shí)采用的色譜條件為：以甲醇-0.5%冰醋酸（30∶70）為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃。

2.3不同地區(qū)紅蔥中槲皮素含量的測定結(jié)果

分別取同心、鹽池紅蔥樣品液20 μL，采用以上色譜條件進(jìn)行測定。色譜分離測定結(jié)果表明，樣品中槲皮素與山奈酚色譜分離效果良好，由所得峰面積計(jì)算得出同心紅蔥中槲皮素的含量為0.969 3 mg/mL，鹽池紅蔥中槲皮素的含量為1.283 1 mg/mL。

2.4不同地區(qū)紅蔥中山奈酚含量的測定結(jié)果

分別取同心、鹽池紅蔥樣品液20 μL，采用以上色譜條件進(jìn)行測定。色譜分離測定結(jié)果表明，樣品中槲皮素與山奈酚色譜分離效果良好，由所得峰面積計(jì)算得出同心紅蔥中山奈酚的含量為1.833 2 mg/mL，鹽池紅蔥中山奈酚的含量為2.251 9 mg/mL。

2.5不同地區(qū)紅蔥及白蔥中槲皮素、山奈酚含量的比較分析

按照上述測定方法對(duì)銀川市售白蔥中的槲皮素與山奈酚含量分貝進(jìn)行了測定，結(jié)果得出，槲皮素的含量為0.623 1 mg/mL，山奈酚的含量為1.074 4 mg/mL，如表2中所示。

圖4　不同比例甲醇-0.5%冰醋酸時(shí)的槲皮素與山奈酚色譜圖Fig.4　Chromatogram of quercetin and kaempferol in different ratio of methanol-0.5%acetic acid by HPLC

表2　紅蔥中槲皮素和山奈酚含量測定結(jié)果Table 2　The contents of quercetin and kaempferol in red onions

通過對(duì)比分析可以看出，2個(gè)地區(qū)紅蔥中槲皮素與山奈酚的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于白蔥；同時(shí)，鹽池紅蔥中的槲皮素和山奈酚含量又明顯高于同心紅蔥，如圖5所示。

圖5　不同產(chǎn)地蔥中槲皮素和山奈酚含量比較Fig.5　Comparison the contents of quercetin and kaempferol of onions in different area

3　結(jié)論

1）本試驗(yàn)采用超聲波+甲醇提取法對(duì)紅蔥中的槲皮素與山奈酚進(jìn)行提取，最佳提取條件為超聲溫度為60℃、超聲時(shí)間為50 min、甲醇濃度為75%。對(duì)得到的供試品溶液利用高效液相色譜法進(jìn)行了測定，確定最佳色譜條件為：色譜柱XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇：0.5%冰醋酸=30∶70，流速為1.0 mL/min，檢測波長290 nm，柱溫30℃。

2）對(duì)兩個(gè)不同地區(qū)的紅蔥中槲皮素和山奈酚含量的進(jìn)行測定分析，并與市售白蔥中的含量進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，同心紅蔥中槲皮素與山奈酚含量分別為（0.969 3±0.03）mg/mL和（1.833 2±0.08）mg/mL；鹽池紅蔥中槲皮素與山奈酚含量分別為（1.2831±0.04）mg/mL和（2.2519±0.06）mg/mL；市售白蔥中槲皮素與山奈酚含量分別為（0.6231±0.01）mg/mL和（1.074 4±0.03）mg/mL。通過比較分析，紅蔥中槲皮素與山奈酚含量均明顯高于市售白蔥，而鹽池紅蔥中槲皮素與山奈酚含量也均明顯高于同心紅蔥，這可能與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、氣候、種植方法有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.036

收稿日期：2014-05-22

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)科技支撐計(jì)劃--育種專項(xiàng)課題（2014）；寧夏科技扶貧致富指導(dǎo)員項(xiàng)目（nxkjt201406）

作者簡介：劉慧燕（1977—），女（漢），講師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)加工及貯藏工程。

*通信作者：方海田（1978—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

HPLC Determination of Quercetin and Kaempferol in Allium cepa var.Proliferum from Ningxia

LIU Hui-yan，F(xiàn)ANG Hai-tian*，ZHANG Guang-di，SHI Juan，ZHANG Yong-jian
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：The determination method and extracting conditions of flavonoids in two types of red onions from Ningxia were mainly investigated，and compared with those of Chinese onions in our study.Taking Tongxin red onions，Yanchi red onions and Chinese onions as the research objects，extract of quercetin and kaempferol were extracted with methanol+ultrasonic extraction methods from three different samples，and the extraction conditions was optimized by the orthogonal experimental design methods.Then the contents of quercetin and kaempferol in three different samples were determined by high-pressure liquid chromatography（HPLC），and the determination conditions were optimized.The results showed that the optimum extraction conditions were：ultrasonic temperature 60℃，ultrasonic time 50 min，methanol concentration 75%.The optimal determination conditions were Agilent XDB-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the column temperature was 30℃，mobile phase was methanol：0.5%acetic acid=30∶70，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 290 nm.As the comparative analysis，the contents of quercetin and kaempferol in two red onions were significantly higher than those of Chinese onions，and the contents of quercetin and kaempferol in Yanchi red onions were obviously higher than those of Tongxin red onions.

Key words：Allium cepa var.proliferum；quercetin；kaempferol；extraction；determination