香蕉多糖的抗菌活性研究

沈建林，沈紅元（湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感432000）

香蕉多糖的抗菌活性研究

沈建林，沈紅元*
（湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感432000）

摘要：采用15%乙醇溶液作為溶劑提取香蕉多糖，并采用紙片瓊脂擴(kuò)散法研究了香蕉多糖的抗菌活性。實驗發(fā)現(xiàn)香蕉多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抗菌活性測試均具有抗菌作用，其中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的最小抗菌濃度（MIC）分別為15、25、20 mg/mL。

關(guān)鍵詞：香蕉；多糖；提取；抗菌

多糖具有多方面的復(fù)雜生物活性與功能，多糖的糖鏈能控制細(xì)胞的分裂與分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。在抗腫瘤、抗病毒以及抗白血病等的防治上具有獨特的功效。多糖在抗凝血、降血糖、降血脂方面的作用研究比較多，這為治療和預(yù)防心腦血管疾病提供了一個熱點領(lǐng)域。此外，多糖抗氧化活性、對雙歧桿菌增殖、抗?jié)儭⒖咕鶾1-2]等作用研究也屢見報道。

日本帝國大學(xué)藥學(xué)部研究發(fā)現(xiàn)香蕉果汁有增強(qiáng)免疫功能、抑制癌細(xì)胞增殖、縮小癌癥病灶、預(yù)防大腸菌及葡萄球菌感染等效果，這一新發(fā)現(xiàn)引起了醫(yī)學(xué)界、食品業(yè)界的高度關(guān)注。香蕉中含糖量近20%，但目前國內(nèi)外對香蕉多糖生物活性研究的相關(guān)報道較少。而越來越多的多糖活性研究顯示，香蕉的某些營養(yǎng)功能和藥理作用很可能與其高含量的多糖成分有關(guān)。本文對香蕉多糖的抗菌活性進(jìn)行了初步研究，為探討香蕉多糖在醫(yī)學(xué)上的深入研究和應(yīng)用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　香蕉多糖的提取及純化

1.1材料及檢測方法

1.1.1材料

香蕉：市售普通香蕉。

1.1.2試劑

丙酮（分析純）：沙市化學(xué)試劑廠；無水乙醇（分析純）：上海振興化工廠；蒽酮（分析純）：上海五聯(lián)化工廠；葡萄糖（分析純）：汕頭西隴化工廠；活性炭（分析純）；纖維素酶（分析純）：上海伯奧生物科技有限公司提供，酶活≥15 U/mg；果膠酶（分析純）：SERVA公司提供，酶活≥0.35 U/mg；正丁醇、氯仿均為分析純；青霉素、鏈霉素：購于湖北省腫瘤醫(yī)院。

供試菌種：埃希大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌。

1.1.3儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；GL20A全自動高速冷凍離心機(jī)：湘西儀器儀表總廠機(jī)械儀器廠；DZF-6021型真空干燥箱：上海益恒實驗儀器有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計：尤尼卡儀器有限公司；8000目透析袋；ALPHA 1-4冷凍干燥機(jī)（CHRIST）；40公分立式高壓蒸氣消毒器：武漢國光醫(yī)療器械廠；血球計數(shù)板；顯微鏡。

總糖測定方法：蒽酮-硫酸法[3]。

1.2香蕉多糖的提取及純化

從植物中提取多糖成分多用水或稀堿，由于香蕉中含有多酚氧化酶，使香蕉氧化，故先對香蕉進(jìn)行熱燙滅酶預(yù)處理，再加纖維素酶、果膠酶酶解，以破壞香蕉細(xì)胞壁，最后用溶劑浸提，乙醇沉淀提取香蕉多糖。然后，通過一系列步驟除去了香蕉多糖中的雜質(zhì)，包括除蛋白質(zhì)，無機(jī)鹽和小分子糖等。

1.2.1熱燙

選用皮黃帶少量褐斑的九成熟普通香蕉，清洗干凈，剝皮后切段，按文獻(xiàn)[4]的方法高溫蒸氣滅酶（105℃，5 min）后迅速降溫，然后用食品打漿機(jī)打成香蕉漿。

1.2.2凍融

香蕉漿用低溫冷凍20 min后，迅速移至40℃水浴處理15 min，反復(fù)處理3次，以破壞其細(xì)胞壁。

1.2.3酶解

取凍融后的香蕉漿加0.5%果膠酶和0.2%纖維素酶，在45℃水浴中酶解2 h。

1.2.4浸提

用15%乙醇溶液，在90℃水浴中浸提2 h，提取2次，合并提取液。將提取液進(jìn)行離心（5 000 r/min，10 min）分離，去渣，取上清液濃縮。

1.2.5醇沉

采用低壓濃縮法對樣品進(jìn)行濃縮，濃縮比約為5∶1。濃縮液用4倍體積95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液沉淀，靜置2 h～4 h后離心（5 000 r/min，10 min）分離，沉淀再用少量水溶解，用95%乙醇再沉淀1次，離心取沉淀。

1.2.6除蛋白質(zhì)

本試驗采用Sevag法除蛋白質(zhì)。先將香蕉粗多糖用適量雙蒸水溶解，將Sevag試劑[氯仿∶正丁醇（體積比）=4∶1混合]加至樣品中，攪拌，蛋白質(zhì)在水和Sevag試劑間形成凝膠，離心分液除去，反復(fù)操作5次～8次。

1.2.7脫色

將樣品通過活性炭柱進(jìn)行脫色。

1.2.8透析

用8 000目透析袋進(jìn)行透析。

1.2.9脫水

再經(jīng)過濃縮、醇沉，再將沉淀先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌2次。

1.2.10真空干燥

將脫水后的樣品低溫真空干燥，至恒重，即得香蕉多糖。真空干燥等得到香蕉多糖，蒽酮-硫酸法測得其總糖含量為90.56%。

2　香蕉多糖的抗菌活性研究

細(xì)菌對抗菌活性物質(zhì)的敏感試驗，是指在體外測定活性物質(zhì)抑菌或殺死細(xì)菌的能力。抗菌活性實驗的測定方法頗多，目前常用的都是基于擴(kuò)散法和稀釋法兩種。本文采用紙片瓊脂擴(kuò)散法[5]對香蕉多糖的抗菌活性進(jìn)行了初步研究，包括香蕉多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抗菌活性測試。

2.1抗菌圈試驗

2.1.1材料

供試培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（直徑90mm平皿，瓊脂厚4mm）。按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確稱取各組分放入燒杯中。在燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，加熱使其溶解。等藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分至所需總體積。將瓊脂放入已溶化的藥品中，在加熱過程中不斷攪拌，最后，補(bǔ)足所失的水分。調(diào)節(jié)pH至7.1。1.05kg/cm2、121.3℃，滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｅ浞饺缦拢号Ｈ怆? g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.1。

增菌培養(yǎng)及菌液的配制將菌種劃線于牛肉胨膏蛋白胨平板上，35℃培養(yǎng)24h，分出其單個菌落，將單個菌落接種到牛肉膏蛋白胨肉湯中，35℃培養(yǎng)24 h，然后用血球計數(shù)板確定菌的濃度，MH肉湯稀釋后使其最終菌量（集落形成單位，CFU）為1.5×108CFU。

含受試物及陽性對照藥物的干燥紙片 選用新華1號定性濾紙，用打孔機(jī)制作直徑6.20 mm的小圓片，置于平皿內(nèi)高壓滅菌（103.4 kPa，20 min），取出后置于烘箱內(nèi)烘干，分裝于滅菌小瓶內(nèi)。以無菌蒸餾水將香蕉多糖配成40、60、80 mg/mL、青霉素和鏈霉素稀釋成50 mg/mL。取稀釋液1 mL加入裝有紙片的小瓶中，浸泡1.5 h，然后真空干燥，保存于冰箱中。

2.1.2原理與方法

將含有—定量的抗菌藥物紙片，平貼在已經(jīng)接種被測細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，紙片中的抗菌藥物溶解于培養(yǎng)基內(nèi)，并向四周呈球面擴(kuò)散，抗菌活性物質(zhì)在瓊脂中的濃度隨離開紙片的距離增大而降低。同時，含菌瓊脂經(jīng)孵育后細(xì)菌開始生長。在瓊脂內(nèi)的藥物濃度恰高于該物質(zhì)對待檢菌的最低抗菌濃度時，該細(xì)菌的生長就受到抑制，在紙片的周圍形成透明的抗菌環(huán)。觀察抗菌環(huán)的有無及其大小，就可以判斷其敏感性。

用棉拭了蘸取菌液（菌液濃度為1.5×108CFU/mL）涂布整個培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，保證涂布均勻。

用鑷子分別夾取含有香蕉多糖、青霉素和鏈霉素的濾紙片，貼在巳接種細(xì)菌的瓊脂平板的表面。每個平板各紙片中心相距約24 mm，紙片距平皿邊緣約15 mm，各紙片間距離相等。

37℃培養(yǎng)24 h后，觀察抗菌圈的有無及其大小。測量香蕉多糖紙片抗菌環(huán)的直徑（以mm表示），并與陰性、陽性對照比較，判斷其敏感性。

2.1.3試驗結(jié)果

香蕉多糖對供試菌種的抗菌圈見表1。

表1　香蕉多糖對供試菌種的抗菌圈Table 1　The antibacterial range of banana polysaccharide to bacteria substitute

2.2最小抗菌濃度（MIC）測定試驗

2.2.1原理與方法

將各供試菌種進(jìn)行活化后，分別用接種環(huán)挑取適量細(xì)菌，用無菌生理鹽水稀釋，振蕩2 min，調(diào)整菌液濃度為約100個/mL，取各種菌懸液0.1 mL，分別加入到含有各種濃度（35、30、25、20、15、10、5 mg/mL）的香蕉多糖的液體培養(yǎng)基中，充分搖勻，37℃培養(yǎng)24 h。取出觀察，如果管底有膜狀生成物或試管內(nèi)液體渾濁則為陽性管；管內(nèi)液體澄清，肉眼未見有菌生長者為陰性管。找出最小抗菌濃度的陰性管，即為其最小抗菌濃度（MIC）。

2.2.2試驗結(jié)果

香蕉多糖對供試菌種的最小抗菌濃度見表2。

試驗數(shù)據(jù)顯示，香蕉多糖對大腸桿菌的最小抗菌濃度為15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抗菌濃度為25mg/mL，對綠膿桿菌的最小抗菌濃度為20mg/mL。

表2　香蕉多糖對供試菌種的最小抗菌濃度Table 2　The minimum antibacterial concentration of bananapolysaccharide to bacteria substitute

3　討論

從香蕉多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抗菌活性測試結(jié)果的抗菌環(huán)直徑與陰性、陽性對照比較來看，香蕉多糖對3種細(xì)菌具有一定的抗菌活性，但其抗菌活性較弱。這有可能與受試香蕉多糖沒有水解有關(guān)，因為多糖水解程度高低與潛在的抗菌活性基團(tuán)的暴露可能有著非常密切的關(guān)系[6]。這提示，要對香蕉多糖的抗菌活性進(jìn)行進(jìn)一步的確定必須從其不同程度的水解產(chǎn)物入手。當(dāng)然，從香蕉多糖的抗菌活性大小來看，其活性還是較弱的，可能是香蕉多糖的分子結(jié)構(gòu)中的抗菌活性基團(tuán)很少或者活性并非很強(qiáng)；或者是香蕉多糖對某些菌種具有特異性的抗菌活性，而非廣譜抗菌，這些有待于進(jìn)一步的試驗證實。今后還應(yīng)更深入從其結(jié)構(gòu)入手，系統(tǒng)地研究其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉春蘭,楊逸,何林,等.植物多糖抑菌作用研究方法進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(7):1725-1727

[2]張海艷,鄭玲.馬齒莧多糖的提取及體外抗菌活[J]性.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):413-415

[3]李如亮.生物化學(xué)實驗[M].武漢:武漢大學(xué)出版社,1998

[4]李光磊,惠明.王清德,等.香蕉中多酚氧化酶特性探討[J].糧油加工與食品機(jī)械,2001(6):27-28

[5]張卓然.醫(yī)學(xué)微生物實驗學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1998:52-55

[6]郭凌,包惠燕,葉紹明,等.瓊枝麒麟菜和異枝麒麟菜硫酸多糖及其水解產(chǎn)物的抑菌作用[J].暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2002,23 (3):79-83

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.017

收稿日期：2014-05-08

作者簡介：沈建林（1970—），男（漢），副教授，碩士研究生，主要從事功能性食品開發(fā)與研究。

*通信作者

Studies on Antibacterial Activity of Banana Polysaccharide

SHEN Jian-lin，SHEN Hong-yuan*
（Hubei Polytechnic Institute，Xiaogan 432000，Hubei，China）

Abstract：By extracting the banana polysaccharide after using the 15%ethanol solution as the solvent，the authors studied its antibacterial activity by Disc agar diffusion method.From experiments，the authors discover that the banana polysaccharide had antibacterial effects on escherichia coli，staphylococcus aureus and pseudomonas by antibacterial activity tests，while the minimum antibacterial concentration（MIC）of escherichia coli，staphylococcus aureus and pseudomonas was 15，25，20 mg/mL respectively.

Key words：banana；polysaccharide；extracting；antibacterial