SPE-HPLC檢測動物源性食品中3種氟喹諾酮類藥物殘留

池永紅，云雅光（包頭輕工職業技術學院，內蒙古包頭014035）

SPE-HPLC檢測動物源性食品中3種氟喹諾酮類藥物殘留

池永紅，云雅光
（包頭輕工職業技術學院，內蒙古包頭014035）

摘要：以3種氟喹諾酮類抗菌藥物-諾氟沙星、環丙沙星，恩諾沙星為研究對象，結合固相萃取串聯高效液相色譜，建立動物源性食品中3種分析物殘留的準確、靈敏的分析方法。研究采用Cleanert S C18固相萃取小柱為基質凈化柱，以Hypersil-ODS C18柱（4.6 mm×250 mm）為液相分離柱，0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液（pH 2.4）∶乙腈為82∶18（體積比）為流動相，流速0.8 mL/min，能夠達到基質凈化和分析物富集、分離目的。根據實驗結果，所建立的方法對3種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限分別達到1.5、1.3、1.5 μg/L；對3個添加濃度下的雞肉、雞蛋、牛奶和牛肉等復雜食品樣品中3種分析物殘留的檢測也具有較高的準確度（回收率>90.0%）和重現性（RSD<5.0%，n=3）。

關鍵詞：氟喹諾酮類藥物；固相萃取；高效液相色譜；檢測

肉類、奶類等動物源性食品營養豐富，是人類獲取動物蛋白的主要途徑。然而獸用藥物在畜牧和漁業生產過程中的不當或非法使用，使動物源性食品成為風險較高、隱患較多的食品之一。近年來，動物源性食品中獸藥殘留日趨嚴重，成為影響其質量的重要因素，嚴重威脅了人類的身體健康，也影響了相關產品出口貿易的進行，極度制約了我國食品經濟的發展。

喹諾酮類藥物（Quinolones，QNs）是指人工合成的含有4-喹酮母核的一類抗菌藥物，臨床上主要治療細菌感染性疾病[1-4]。該類藥物通過抑制細菌體內的拓撲異構酶Ⅱ和Ⅳ活性，進而抑制DNA的復制起到殺滅細菌作用[5-6]。而氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，FQNs）由于在C6位上引入的F，從而大大提高了抗菌作用，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、衣原體、支原體以及結合桿菌等均有明顯作用，逐漸成為QNs的主流[7-8]。

諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、環丙沙星（Ciprofloxacin，CIPRO）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENRO）是3種典型的FQNs藥物，也是目前獸醫臨床上用量最大、范圍最廣的抗菌藥物[9]。一般認為，這3種藥物不滯留于動物組織，但大劑量使用容易導致在生物體內產生蓄積毒性和細菌耐藥性，并引發一系列不良反應如神經中毒、腎功能損傷、過敏反應等[10-11]。因此，許多國家和組織等都將其列入限制使用的獸藥范圍，并制訂出相應的最高殘留限量（MRL）[12]。美國已禁止在食用動物養殖中使用FQNs；歐盟（EC）則規定恩諾沙星與環丙沙星在動物肌肉、肝臟和腎臟中的最大殘留量之和分別為100、200和300 μg/kg。在我國，國家質監總局也規定了諾氟沙星、恩諾沙星在動物肌肉、肝臟和腎臟中的MRLs值分別為100、200、300 μg/kg[13]。

高效液相色譜分析方法是目前針對動物源性食品中FQNs殘留檢測的主要方法之一[14]，具有高準確度、高靈敏度的特征。另一方面，由于動物源性食品基質復雜，本身存在較多脂肪、蛋白質等物質，不利于其中痕量存在的FQNs藥物殘留的準確測定，通常需要嚴格的樣品前處理過程。所以，針對動物源性食品中FQNs殘留，尋找一種集基質凈化、痕量有害物富集于一體的準確、靈敏、快速的分析檢測方法具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀配熒光檢測器（LC20ARF10AXL）：Shimadzu，Japan；勻漿組織破碎機（AM-6，Japan）；臺式冷凍離心機（Centrifuge 5804R）：德國Eppendorf公司；振蕩器（QL-901）：海門其林貝爾儀器制造有限公司；固相萃取柱（Cleanert S C18 100 mg，3 mL）：Agela Technologies公司；超純水系統（18.2 MΩ cm）：Water Pro watersystem，Labconco Corp.USA。

諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星標準品：購于浙江國邦藥業有限公司；甲醇，乙腈（色譜純）等有機溶劑：購于天津化學試劑一廠。去離子水自制。

雞肉、魚肉、豬肉、雞蛋、牛奶、牛肉，購于本地超市。1.2液相色譜條件

高效液相色譜儀配熒光檢測器，激發波長EX：280 nm，發射波長EM：450 nm；色譜柱：Hypersil-ODS C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L H3PO4-三乙胺溶液∶乙腈（82∶18，體積比），用前超聲脫氣30 min，恢復到室溫，備用；流動相流速：0.8 mL/min，進樣量：20 μL，無柱溫。

1.3標準溶液的配制

準確稱取諾氟沙星、環丙沙星及恩諾沙星標準品各0.010 g，分別溶解于0.05 mol/L H3PO4溶液中，并定容到100 mL，搖勻即得100.0 mg/L標準品儲備液，4℃冷藏，儲存期1個月。

準確量取3種標準品儲備液1.0 mL，用0.05 mol/L H3PO4稀釋定容至100 mL，即得1.0 mg/L標準工作液。分別量取5、10、25、50、100、200、250 μL 1.0 mg/L標準工作液于定量瓶中，稀釋至1.0 mL，搖勻得到濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L系列標準溶液。

1.4樣品前處理

準確稱取粉碎的雞肉、魚肉、豬肉樣品各2.00 g分別置于25 mL離心管中，分別加入乙腈5.0 mL和0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）5.0 mL，漩渦振蕩，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用；對所得的組織殘渣重復提取一次。合并所得的上清液中加入20.0mL水飽和正己烷，充分搖勻，靜置分層，取下層萃取液（組織提取液）備用。

試驗選用C18（100 mg，3 mL，300 A）固相萃取小柱作為基質凈化柱。固相萃取柱用前依次用5.0 mL去離子水，5.0 mL乙腈進行活化，取10.0 mL組織提取液以均勻流速（約0.5 mL/min）上樣，2.0 mL去離子水淋洗，以2.0 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液洗脫，恒定氮氣氣流吹干，乙腈復溶至1.0 mL，上機分析。

2　結果與分析

2.1色譜條件優化與選擇

試驗檢測的3種氟喹諾酮類藥物化學結構中均有羧基和哌嗪環結構，化學性質上存在兩性特征。在研究中選用了酸性溶液（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）與乙腈（82∶18，體積比）為流動相，并添加適量三乙胺作為掃尾劑改善峰形。同時由于鹽溶液與有機相混合時容易產生結晶，會使液相色譜儀管路堵塞。實驗中以三乙胺調整磷酸溶液pH分別達到1.8～4.5，優化pH對3種氟喹諾酮類藥物的分離情況。結果表明，當流動相pH在1.8～3.0范圍內時，3種分析物的保留時間基本不變，且峰形對稱，分離效果良好。當pH超過3.0時，恩諾沙星的峰形變寬，有明顯拖尾現象。結合其他文獻和研究，實驗中采用低濃度磷酸-三乙胺（0.05 mol/L H3PO4溶液，pH 2.4）與乙腈（82∶18，體積比）混合溶液為流動相，不僅能夠獲得良好的峰形，也能有效地避免鹽類的結晶。

2.2標準曲線的繪制

按照2.3所示方法配制不同濃度（X，μg/L）的3種分析物的標準工作液，并按實驗所列色譜條件進行分析測定，以保留時間（諾氟沙星：6.43 min；環丙沙星：8.82 min；恩諾沙星：12.06 min）定性（圖1），外標法峰面積（Y）定量，可得3種分析物的標準曲線（圖2）。

圖1　諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星3種氟喹諾酮類藥物的液相色譜圖Fig.1Chromatograms of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

圖2　3種氟喹諾酮類藥物-諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的標準曲線Fig.2　The standard curves of three FQNs-NOR，CIPRO and ENRO

試驗中，3種氟喹諾酮類藥物的標準曲線分別為：諾氟沙星：Y=31 719 X+36 7812（R2=0.995 8）；環丙沙星：Y=27 453 X+150 141（R2=0.998 7）；恩諾沙星：Y=448 665 X+407 300（R2=0.999 8）。3種目標分析物都具有良好的分離度，峰面積與濃度之間呈現良好的線性關系。以最低濃度5.0 μg/L的測試數據計算3倍信噪比求得檢出限為1.5μg/L（NOR），1.3μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）。

2.3實際樣品檢測

研究中以雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉為代表動物源性食品進行添加回收試驗，以考察所建立的基質凈化方法及3種沙星類抗菌藥物檢測方法的實際應用能力。準確稱取的雞肉、雞蛋、牛肉、魚肉、豬肉樣品各2.0 g及牛奶2.0 mL，分別進行諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星濃度為10、20、30 ng/g（或ng/mL）的梯度添加，每個濃度平行3個，樣品前處理過程如上所述?；|提取液上機分析取峰面積根據標準曲線計算3種目標分析物的濃度，以加入量與測得量之比計算回收率及變異系數。結果如表1所示。

表1　雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中三種氟喹諾酮類抗菌藥的檢測結果Table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

續表1　雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中三種氟喹諾酮類抗菌藥的檢測結果Continue table 1　Results of three FQNs detection in chicken muscle，eggs，milk，beaf，fish and pork samples

3　結論

本研究建立了固相萃取串聯高效液相色譜法測定動物源性食品雞肉、雞蛋、牛奶、牛肉、魚肉、豬肉中諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的殘留。通過試驗結果比較，確定了色譜條件及樣品前處理過程，使其達到良好分離。對于3種分析物的線性范圍在50.0 μg/L～500.0 μg/L時的相關系數大于0.99；選定的6種動物源性食品中3種藥物殘留的加標回收率均大于90.0%；相對標準偏差小于5.0%。該方法具有簡便、快捷、精密度和準確性高的特點，能夠滿足常見動物源性食品中諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星檢測的技術要求。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.041

收稿日期：2015-07-22

作者簡介：池永紅（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品發酵和食品檢測。

Determination of Three Fluoroquinolones in Animal-derived Food by Combining SPE with HPLC

CHI Yong-hong，YUN Ya-guang
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，Inner Mongolia，China）

Abstract：An accurate and sensitive method for the detection of three fluoroquinolones-norfloxacin（NOR），ciprofloxacin（CIPRO），enrofloxacin（ENRO）residues in animal-derived food products was developed by combining solid-phase extraction with high performance liquid chromatography.The Cleanert S C18 solidphase extraction column was used for complex matrix purification and one Hypersil-ODS C18 column（4.6 mm× 250 mm）was employed for separation in liquid chromatography.The mobile phase consisted of 0.05 mol/L H3PO4was controlled pH at 2.4 by triethylamine and mixed with ACN at the ratio of 82∶18（volume ratio），and the flow rate controlled at 0.8 mL/min for the purpose of obtaining good substrate clean-up and analytes enrichment.Based on the obtained resluts，the detection limit of three chosen analytes achieved to 1.5 μg/L （NOR），1.3 μg/L（CIPRO），1.5 μg/L（ENRO）in the developed method，good recoveries in chosen chicken muscle，egg，milk and beef samples at three spiked levels of NOR，CIPRO and ENRO were obtained higher than 90.0%with RSD less than 5.0%（n=3），meaning that the developed method in this research was high accuracy and reproducibility.

Key words：fluoroquinolones；SPE；HPLC；detection