產酸性蛋白酶菌株的誘變育種研究

曲　波（吉林工程職業學院，吉林四平136001）

產酸性蛋白酶菌株的誘變育種研究

曲波
（吉林工程職業學院，吉林四平136001）

摘要：從玉米浸泡液中篩選產酸性蛋白酶的菌株，命名Y-5.0，通過對選育獲得的Y-5.0進行紫外-亞硝基胍交替誘變研究發現：紫外誘變最佳菌體稀釋度為10-5、最佳照射時間為20 s；NTG誘變最佳濃度為500 μg/mL、最佳誘變稀釋度為10-4、最佳誘變作用時間為50 min。通過三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變篩選獲得高產蛋白酶的菌株N3-15，其產蛋白酶的活力最高為12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且該菌株N3-15傳代5次產量穩定。

關鍵詞：蛋白酶；菌株；誘變

從自然界經稀釋涂布分離得到的菌種，由于其生產能力較低，一般不能滿足工業化大規模的生產。因此，采用物理或化學誘變方法選育高產的誘變菌株，彌補生產能力低的不足，這已成為一種常規的選育菌種技術[1]。其中紫外線是最常用的一種物理誘變方法，它直接作用于DNA，使其相鄰的胸腺嘧啶轉變成二聚體，其優點是危險性小、誘變效果較好。常用的化學誘變劑主要采用烷化劑中的亞硝基化合物，它的主要作用是引起DNA鏈中GC和AT的轉換，享有超誘變劑之稱[2]。

本試驗以玉米浸泡液中篩選獲得一株產蛋白酶的菌株Y-5.0為出發菌株，經過紫外-化學三輪交替誘變處理，篩選出一株高產蛋白酶的突變株，為進一步提高蛋白酶的活力奠定良好基礎[3]。

1　材料、儀器及設備

1.1菌種

Y-5.0：中糧生化能源有限公司（公主嶺市）生產車間的玉米浸泡液中篩選獲得。

1.2試劑

亞硝基胍（NTG）、酵母膏、瓊脂、葡萄糖、酪蛋白、蛋白胨、（NH4）2SO4、CaCl2、FeSO4·7H2O、KH2PO4、MgSO4· 7H2O、NaCI、磷酸緩沖溶液[4]。

1.3培養基

YEPD培養基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

分離培養基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，1%酪蛋白，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

淀粉培養基：蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，可溶性淀粉0.2 g，NaCl 0.5 g，瓊脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

種子培養基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，pH 6.5。

發酵培養基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，（NH4）2SO40.2 g，CaCI20.02 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 6.5，接種量5%[5]。

1.4儀器與設備

本試驗所用到的儀器與設備詳見表1。

表1　儀器設備Table 1　Instruments and equipments

2　方法

2.1紫外誘變最佳濃度梯度的確定

取對數生長期的菌體制成菌懸液，吸取1 mL用無菌生理鹽水依次梯度稀釋至10-6濃度，分別吸取各稀釋度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD培養基凝固平板中[6]。將涂布平板與紫外燈下照射20 s，避光保存在30℃培養箱中48 h，查數誘變后的菌落個數，確定最佳稀釋梯度[7]。

試驗均以未經過紫外線照射的YEPD培養基平板為對照。

2.2紫外誘變最佳照射時間的確定

取100 μL稀釋度為10-5的菌懸液均勻地涂布到YEPD固體培養基平板中，分別在紫外線燈下照射10、20、30 s。避光保存在30℃培養箱中48 h，查數誘變后的菌落個數，確定最佳紫外照射時間[8]。

試驗均以未經過紫外線照射培養的YEPD培養基平板為對照。

2.3NTG最佳濃度的確定

分別配制濃度為100、300、500μg/mL和700μg/mL 的NTG溶液。取對數生長期的菌懸液離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG誘變40 min-離心-磷酸緩沖液洗滌-取各稀釋濃度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD固體培養基平板中，30℃培養箱中培養48 h，查數誘變后的菌落個數，確定最佳NTG濃度[9]。

2.4NTG誘變最佳作用時間的確定

將對數生長期的菌株制成菌懸液離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG作用不同時間（20、30、40、50、60、70 min）-離心-磷酸緩沖液洗滌-取各稀釋濃度的菌懸液100 μL均勻涂布于YEPD固體培養基平板中，30℃培養箱中培養48 h，查數誘變后的菌落個數，確定最佳NTG誘變時間[10]。

2.5NTG誘變最佳稀釋梯度的確定

取對數生長期菌懸液-離心-磷酸緩沖液洗滌-NTG誘變40 min-離心-磷酸緩沖液洗滌-依次稀釋梯度至10-5，分別取不同稀釋度菌懸液100 μL涂布于YEPD固體培養基中，30℃培養箱中培養48 h，查數誘變后的菌落個數，確定最佳NTG菌體濃度[11]。

2.6紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變育種

取100 μL稀釋度為10-4的對數期菌懸液均勻涂布于YEPD固體培養基平板中，在紫外線燈下照射20s，避光保存在30℃培養箱中48 h。挑選誘變后長勢良好的菌株反復篩選發酵，測定發酵液的蛋白酶活力[12]。將蛋白酶活力高的菌株傳代4次并發酵測蛋白酶活力。

將紫外誘變后產量穩定的的高產菌株經NTG誘變40 min，均勻涂布于YEPD培養基中，30℃培養箱中培養48 h，挑選誘變后長勢良好的菌株反復篩選發酵，測定發酵液的蛋白酶活力。將蛋白酶活力高的菌株傳代5次并發酵測蛋白酶活力。

挑取上述誘變后蛋白酶活力含量較高的高產菌株進行紫外誘變，篩選誘變后的高產菌株發酵測其蛋白酶活力。反復如上，經過三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變，選育高產酸性蛋白酶菌株[13]。挑選誘變后長勢良好的菌株反復篩選發酵，測定發酵液的蛋白酶活力。將蛋白酶活力高的菌株傳代5次并發酵測蛋白酶活力。

試驗均做3個平行樣。

3　結果與分析

3.1紫外誘變最佳濃度梯度的選擇

紫外誘變最佳濃度梯度的選擇試驗結果見表2。

表2　紫外誘變最佳濃度的選擇Table 2　The choice of the best concentration of UV mutagenesis

由于菌體的致死率在70%～80%之間，菌體發生正突變的機率較大。從表2中可看出，當稀釋度為10-4時，菌株的致死率為75.5%，隨著稀釋梯度的減小，菌株的致死率在不斷地增大；因為工作量的原因選擇稀釋度10-5，故在以后的試驗中采用10-5為最佳稀釋度。

3.2紫外誘變最佳時間的確定

紫外誘變最佳時間的確定試驗結果見表3。

表3　紫外誘變最佳時間的確定Table 3　UV mutagenesis to determine the best time

由表3紫外誘變的最佳時間結果顯示：隨著紫外照射時間的延長，菌株的致死率在不斷地增大。當紫外照射的誘變時間為20 s時，誘變菌株的致死率在78.18%，因此確定最佳誘變時間為20 s。

3.3NTG最佳濃度的確定

NTG最佳濃度的確定試驗結果見表4。

表4　NTG最佳濃度的確定Table 4　Determine the optimal concentration of NTG

由表4可以看出最佳NTG濃度為500 μg/mL。表4顯示隨著NTG濃度的不斷增大加，菌株的致死率也在不斷地增加，其在500 μg/mL時滿足致死率在70%～80%的范圍，其向正突變的幾率較大。

3.4NTG最佳作用時間的確定

NTG最佳作用時間的確定試驗結果見表5。

表5　NTG最佳作用時間的確定Table 5　Best time to determine the role of NTG

從表5可以看出NTG最佳作用時間為50 min。表5顯示隨著NTG作用時間的延長，致死率在不斷地增大，其在50 min時滿足致死率在70%～80%的范圍，其向正突變的幾率較大，故確定今后試驗NTG誘變時間為50 min。

3.5NTG最佳稀釋度的確定

NTG最佳稀釋度的確定試驗結果見表6。

表6　NTG最佳稀釋度的確定Table 6　Determination of the optimal dilution of NTG

從表6可以看出，從稀釋度10-3遞增至10-6，致死率在不斷地減少；當稀釋度為10-4時滿足最佳致死率范圍，致死率為70.32%，因此選擇10-4時為最佳NTG稀釋度。

3.6三輪紫外-化學復合誘變

采用Folin-酚法測定光密度OD680nm值，計算蛋白酶酶活力。

表7為第一輪紫外誘變后菌株發酵產蛋白酶的酶活力。

表7　第一輪紫外誘變后菌株發酵產蛋白酶的活力Table 7　After the first round of UV mutagenesis producing protease fermentation

從表7可以看出，突變株UV1-8產蛋白酶的活力最高，達到2 476 nKat/mL。以突變株UV1-8為出發菌株進行以下試驗的NTG誘變。表8為第一輪NTG誘變后菌株發酵產蛋白酶的酶活力。

表8　第一輪NTG誘變后菌株發酵產蛋白酶的活力Table 8　NTG mutant strain after the first round of protease fermentation

從表8可以看出，蛋白酶活力最高的菌株為N1-Ⅴ突變株，蛋白酶活力達到5 226 nKat/mL。

表9為第二輪紫外誘變后篩選出產蛋白酶活力較高的菌株。

表9　第二輪紫外誘變后菌株發酵產蛋白酶的活力Table 9　After the second round of UV mutagenesis producing protease

從表9可以看出，突變株UV2-18的蛋白酶活力最高為7 827 nKat/mL。表10為第二輪NTG誘變后菌株發酵產蛋白酶菌株。

表1　0 第二輪NTG誘變后菌株發酵產蛋白酶的活力Table 10　NTG mutant strain after the second round of protease fermentation

從表10可以看出，突變株N2-Ⅲ蛋白酶活力最高為9 144 nKat/mL。

表11為第三輪紫外誘變后篩選獲得的產蛋白酶活力較高的菌株。

表1　1　第三輪紫外誘變后菌株發酵產蛋白酶活力Table 11　After the third round of UV mutagenesis protease fermentation products

從表11可以看出，UV3-34突變株蛋白酶活力為10 569 nKat/mL。表12為第三輪NTG誘變后篩選獲得的產蛋白酶活力較高的菌株。

表1　2 第三輪NTG誘變后菌株發酵產蛋白酶活力Table 12　NTG mutant strain after the third round of protease fermentation products

從表12可以看出，其中N3-15突變株的蛋白酶活力最高，其蛋白酶活力為12 152 nKat/mL。

將紫外-NTG交替誘變后產蛋白酶活力最高的N3-15突變株連續傳代5次，發酵測定其蛋白酶活力如表13所示。

表1　3第三輪NTG誘變后N3-15菌株5次傳代發酵產蛋白酶活力Table 13　The third round of NTG mutagenesis N3-15 strain of 5 passages fermentation of protease activity

從表13可以看出該突變株產蛋白酶活力穩定，其蛋白酶酶活力為12 152 nKat/mL。

4　結論

通過對選育獲得的Y-5.0進行紫外-亞硝基胍交替誘變研究發現：紫外誘變最佳菌體稀釋度為10-5、最佳照射時間為20 s；NTG誘變最佳濃度為500 μg/mL、最佳誘變稀釋度為10-4、最佳誘變作用時間為50 min。通過三輪紫外和亞硝基胍（NTG）交替誘變篩選獲得高產蛋白酶的菌株N3-15，其產蛋白酶的活力最高為12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且該菌株N3-15傳代5次產量穩定。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.045

收稿日期：2015-03-24

作者簡介：曲波（1982—），男（漢），講師，研究生，研究方向：食品發酵，食品營養。

Research on the Mutation Breeding of Acid Protease-producing Strains

QU Bo
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Abstract：Screening the high-yield strains of acid protease from the corn immersion.The high-yield strains of acid protease was named Y-5.0.Mutagenesis studies of Y-5.0 showed that the best conditions of UV mutagenesis：the dilution of bacteria was 10-5，the best exposure time of UV mutagenesis was 20 s，NTG mutagenesis best conditions：NTG concentration was 500 ug/mL，NTG mutagenesis dilution was 10-4，the best action time of NTG mutagenesis was 50 min.By three times of UV and nitrosoguanidine（NTG）mutation alternately breeding screening，we obtained the highest protease activity mutant named N3-15，the activity of Its producing protease reached 12 152 nKat/mL，far exceeding the activity of the original strain Y-5.0.This strain passed five times and performed a good genetic stability.

Key words：protease；strain；mutagenesis