RP-HPLC法同時測定人血清中4種抗癲癇藥的濃度

胡偉 馬愛玲 劉宣彤 劉如品 王可

RP-HPLC法同時測定人血清中4種抗癲癇藥的濃度

胡偉 馬愛玲 劉宣彤 劉如品 王可

目的建立同時測定人血清中拉莫三嗪(LTG)、苯巴比妥(PB)、苯妥英(PHT)和卡馬西平(CBZ)濃度的高效液相色譜法。方法血清樣品經甲醇沉淀蛋白后直接進樣測定。色譜柱采用Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm), 流動相為甲醇-水(55∶45), 檢測波長235 nm。結果LTG、PB、PHT和CBZ的線性范圍分別是1.56～50、3.13～100、2.19～70、1.09～35 μg/ml, 平均回收率均>98%。結論本方法操作簡便, 結果準確, 適用于臨床治療藥物監測。

拉莫三嗪；苯巴比妥；苯妥英；卡馬西平；高效液相色譜法

PB、PHT和CBZ是傳統的一線抗癲癇治療藥物, 由于這3種抗癲癇藥物的有效血藥濃度范圍較窄, 患者之間個體差異較大, 抗癲癇作用和毒性與在體內的血藥濃度有很大的相關性, 需要進行血藥濃度的監測和個體化給藥。LTG是一種苯三嗪類的新型廣譜抗癲癇藥, 由于該藥與目前常用的抗癲癇藥如PHT、CBZ等在藥動學上存在相互作用, 導致個體間血藥濃度差異較大, 臨床使用時也需要進行血藥濃度的監測和個體化給藥。

高效液相色譜法同時測定血清中LTG、PB、PHT和CBZ濃度國內已有報道。文獻［1-3］中使用的流動相依次為甲醇-乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(20∶13.5∶66.5)、乙腈-磷酸鹽緩沖液(30∶70)、甲醇-磷酸鹽緩沖液(56∶44, V/V, pH5.5), 所用流動相多含有無機鹽或酸, 在實際臨床應用中操作繁瑣, 不利于日常工作的開展。本實驗室采用甲醇-水(55∶45)為流動相, 建立了更為簡單、方便的高效液相色譜法,同時測定上述4種藥物的血藥濃度, 適用于醫療機構開展常見抗癲癇藥物的血藥濃度監測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安P680高效液相色譜儀, AUW120D電子天平(日本島津), WH-866旋渦混合器, TGL-16A(B)高速離心機。

1.2 試藥 LTG對照品(中國食品藥品檢定研究院, 批號：100775-200401)；PB(中國食品藥品檢定研究院, 批號：1222-9602)；PHT(中國食品藥品檢定研究院, 批號：100210-201002)；CBZ(中國食品藥品檢定研究院, 批號：100142-201105)；甲醇為色譜純；水為重蒸水。

1.3 統計學方法 采用DAS2.0藥物代謝動力學軟件對數據進行回歸分析。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(250 mm× 4.6 mm, 5μm)；流動相：甲醇-水(55∶45)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：235 nm；柱溫：35 °C；進樣量：20 μl。

2.2 專屬性考察 取空白血清200 μl, 按“2.4”項下方法處理, 進樣分析, 記錄色譜圖, 結果表明血清中內源性物質對樣品的測定無干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品貯備液的制備 分別準確稱取LTG、PB、PHT和CBZ對照品適量, 用甲醇溶解并定容, 制備成LTG、PB、PHT和CBZ濃度分別為500、1000、700、350 μg/ml的對照品貯備液, 置于-30℃ 冰箱中貯存。

2.3.2 標準血樣的制備 分別精密量取對照品貯備液適量,用甲醇稀釋成為適當濃度的系列混合工作液。取此工作液,加入適量空白人血清, 制成含LTG 1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/ml；含PB 3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、 100.00 μg/ml；含PHT 2.19、4.38、8.75、17.50、35.00、70.00 μg/ml；含CBZ 1.09、2.19、4.38、8.75、17.50、35.00 μg/ml的系列混合標準血樣。

2.3.3 質控血清的制備 分別精密量取對照品貯備液適量,用甲醇稀釋成為低、中、高對照品混合溶液。取此對照品混合溶液, 加入適量空白人血清, 制成含LTG 3.13、12.50、25.00 μg/ml；含PB 6.25、25.00、50.00 μg/ml；含PHT 4.38、17.50、35.00 μg/ml；含CBZ 2.19、8.75、17.5 μg/ml的低、中、高質控血清。

2.4 血清樣本處理 取血清樣品200 μl, 加入甲醇溶液600 μl,渦旋30 s, 15000 r/min離心5 min, 取上清20 μl直接進樣分析。

2.5 線性關系考察 取系列混合標準血樣各200 μl, 按“2.4”項下方法處理, 取上清20 μl進樣分析, 以峰面積Y對濃度X作線性回歸, 得回歸方程與線性關系, 結果表明, 各藥物的峰面積與濃度均呈良好的線性關系。見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.6 精密度試驗 取低、中、高三個濃度質控血清, 按“2.4”項下方法處理, 取上清20 μl進樣分析, 每個樣本連續進樣3次, 計算精密度, 結果表明儀器精密度良好。見表2。

2.7 回收率試驗 取低、中、高三個濃度質控血清, 按“2.4”項下方法處理, 每個濃度平行制備3份, 取上清20 μl進樣分析, 計算方法回收率, 結果表明方法回收率良好。見表2。

表2 精密度與回收率結果

3 討論

文獻［1-3］中均采用內標法, 內標液用甲醇等易揮發有機溶液配成, 不宜長期反復使用, 且操作較煩瑣, 不適于臨床常規監測。外標法進樣量要求十分準確, 本試驗所用的戴安P680高效液相色譜儀配有自動進樣器, 避免了手動進樣的誤差。結果表明, 儀器精密度高、樣品預處理方法操作簡便、快速, 可在短時間內處理大量樣品, 適用于臨床血藥濃度的監測［4］。

色譜條件的選擇尤其是流動相的組成直接影響到日常工作的開展。文獻［1-3］中使用的流動相均含有無機鹽或酸,平衡流動相和沖洗色譜柱時間較長, 干擾因素多, 不利于色譜柱的保護, 在實際臨床應用中操作繁瑣, 不利于日常工作的開展。本實驗室采用甲醇-水(55∶45)為流動相, 上述4種抗癲癇藥物得到了較好的分離, 各藥物峰形良好, 優化了流動相組成, 為準確、快速測定上述4種抗癲癇藥的血藥濃度提供可靠的手段, 可為該類藥物的血藥濃度監測、個體化給藥方案的制定、藥物濫用監測以及藥物代謝動力學研究等方面提供幫助。

LTG、PB、PHT和CBZ的有效血藥濃度分別為3～15、15～40、10～20、4～12 μg/ml, 本實驗中上述4種藥物的線性范圍分別是1.56～50.00、3.13～100.00、2.19～70.00、1.09～35.00 μg/ml,所得線性范圍涵蓋了上述藥物的治療窗, 可滿足臨床治療藥物監測要求。

［1］楊潔, 焦正, 施孝金.高效液相色譜法同時測定人血漿中6 種抗癲癇藥物及兩種活性代謝物的濃度.中國藥學雜志, 2006, 41(24):1899-1902.

［2］劉穎, 王麗, 何大可.RP-HPLC法同時測定卡馬西平、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英鈉及環氧卡馬西平的血清濃度.中國臨床藥理學與治療學, 2005, 10(8):846-851.

［3］劉亦偉, 王長連, 黃品芳.高效液相色譜法同時測定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平的血藥濃度.中國醫院藥學雜志, 2012, 32(23):1660-1662.

［4］劉海濤, 唐躍年.HPLC法測定癲癇患兒血漿中拉莫三嗪的濃度.中國藥房, 2011, 22 (2):128-129.

Simultaneous determination of serum concentration of 4 antiepileptic drugs by RP-HPLC

HU Wei, MA Ai-ling, LIU Xuan-tong, et al.Department of Pharmacy, Henan Xinyang City Central Hospital, Xinyang 464000, China

Objective To establish a simultaneous determination method by high performance liquid chromatography for serum concentration of lamotrigine (LTG), phenobarbital (PB), phenytoin (PHT), and carbamazepine (CBZ).MethodsAfter protein precipitation by methyl alcohol, the serum samples were taken for determination with chromatographic column of Waters Symmetry C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), methyl alcohol-water (55∶45) as moving phase and detection wavelength as 235 nm.ResultsThe linear ranges of LTG, PB, PHT, and CBZ were respectively 1.56～50, 3.13～100, 2.19～70, and 1.09～35 μg/ml.The average recovery rate was >98%.ConclusionThis method is easy operational with precise effect.It is suitable for monitoring of clinical treatment drugs.

Lamotrigine; Phenobarbital; Phenytoin; Carbamazepine; High performance liquid chromatography

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.180

2014-09-23］

464000 河南省信陽市中心醫院藥學部(胡偉劉如品 王可)；河南省人民醫院藥學部(馬愛玲)；哈爾濱醫科大學附屬第四醫院藥學部 (劉宣彤)