流式細胞儀檢測技術與質量控制

劉敏　周曉明　張穎

【摘要】流式細胞術（FCM）檢測HLA等位基因是最近新建立的方法，與原有的分型技術相比，技術上有很大的改進和突破。流式細胞術已廣泛用于臨床常規檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，提高準確度和室間結果的可比性，流式細胞術質量控制越來越受到重視。它在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選，同傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精密度高、準確性好等特點。

【關鍵詞】流式細胞術；檢測技術；質量控制

流式細胞儀檢驗技術（FCM），即流式細胞術，是以流式細胞儀作為檢測手段，以免疫熒光技術作為主要標記方法的一門先進的分析技術。該方法用免疫磁珠作為載體，在同一微孔內進行反應，利用流式細胞儀檢測雜交信號和區分探針的種類。本技術使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用顏色進行標識[1]。當免疫磁珠上兩種顏色混合的比例不同時，經流式細胞儀檢測后即可區分定義為不同種類的免疫磁珠，目前兩種顏色的組合在流式細胞儀上最多可區分成為100種不同的免疫磁珠。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集近3年本院治療的30例患者，對30例患者行流式細胞儀檢測，30例受檢者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年齡60歲，最小年齡17歲，患者平均年齡39歲。

2 檢測方法

2.1 采用特定的免疫磁珠作為載體，將已知序列特異性探針（SSO）固定在免疫磁珠上，每一種特異性探針固定在已知顏色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上顏色比例的不同，在流式細胞儀紅色激光束下可進行區分，根據事先設計的標記情況，通過流式細胞儀檢測后可確認特定顏色比例免疫磁珠上攜帶的特異性探針的種類，從而達到將探針區分的目的。

2.2利用標記的特異性引物對目的DNA進行擴增，將PCR擴增產物與免疫磁珠上的序列特異性探針（SSO）在同一孔內進行特異性雜交，再加入熒光顯色劑，然后利用流式細胞儀綠色激光束檢測雜交信號，紅色激光束區分探針的種類，利用軟件分析雜交結果得出樣本HLA基因型別。

3 方法學評價 該方法與PCR-SSO有相似的地方，但是技術上有重大的突破。本方法靈敏度非常高，在96孔微板上可進行大規模的檢測，實現了所有探針的雜交于液相條件下在同一個孔內進行，而且采用免疫磁珠作為載體，具有快速、簡便、可靠的優點，平均每個孔在流式細胞儀上檢測的時間不到30s。目前已有商品化的試劑供應，同時該技術也廣泛應用于其他方面（如傳染病指標等）的檢測和研究。

4 討論

流式細胞術常規測定由一系列繁瑣的步驟組成，大體可分為樣本采集和處理、免疫熒光染色、流式細胞儀檢測、數據分析及結果報告解釋，做好這些步驟中每一環節的工作可以確保室內質量控制（1Qc）和室間質量控制（EQA）順利達標。

標本采集和制備，用于流式細胞分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液及組織等，每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。原則上標本應在采集后立刻進行處理和熒光染色，尤其對檢測細胞活性的標本，需要在采集后1小時內染色測定。在某些特殊情況下不能及時進行標本制備和檢測而需要保存時，EDTA抗凝的標本在室溫下可保存12～24小時，肝素抗凝通常在室溫下可保存至48～72小時，枸櫞酸抗凝在室溫下可保存至72小時，對于只作胞內染色的樣本，根據待分析細胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定細胞后保存數周。

流式細胞儀的校準通常包括液路的穩定性、光路的穩定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩定性等[2]。儀器校準品主要成分為聚苯乙烯，它被制成各種大小或同時擁有定量免疫球蛋白結合位點的熒光微球，這種制成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式細胞儀質控中的一種常用的標準品。

精密度及其校準微球精密度是通過對標準熒光微球檢測其散射光和熒光的分布范圍來描述的，通常以變異系數CV%來說明，CV%小于5可以滿足大多數實驗的要求。但細胞周期和倍體分析對儀器的精密度要求很高的，均質性細胞間的變異必須小于2%。靈敏度及其校準微球流式細胞儀的靈敏度可有多種表達方式，目前使用最為廣泛的方式是可溶性熒光染料等價分子數（MESF）法。該方法所用試劑盒由一系列標記有MESF值的微球組成（包括未標記熒光的空白微球），表明該微球所標記熒光物質的熒光強度等同于溶液中熒光染料的分子數，根據微球檢測結果的平均熒光強度進行線性回歸分析，可得到流式細胞儀靈敏度的回歸曲線，回歸曲線與Y軸的交點即為該機的靈敏度，或叫做最低檢測限度[3]。準確度及其校準流式細胞儀的準確度同精密度和靈敏度相比不很重要，但隨著定量流式細胞技術的發展和熒光定量分析在實際工作中的需求越來越大，流式細胞儀準確度的評價和質控品也開始受到重視，在樣品中加入內標或某些生物活細胞，如雞或魚的紅細胞，可對儀器準確度進行有效監測。當使用兩種或以上的熒光素進行分析時，激光激發下的相鄰或相近熒光素發出的熒光會產生交叉重疊，從而干擾檢測結果，通過調整熒光補償，可以保證每個檢測器檢測到恰當的單一熒光信號，即保證了結果的可靠性。熒光補償是流式細胞術多色分析前必須進行的儀器校準，通常采用每種熒光素或相應的標記抗體對抗原表達量適中的細胞進行單染色，來進行儀器補償調整，也可以通過商品化熒光補償試劑進行。當使用各種標準微球對儀器進行校正時，需要將微球測定結果繪制成質控圖，Levey-Jennings質控圖是目前在臨床檢驗質量控制中使用較多的方法，根據Levey-Jennings質控圖的評價要點來觀察質控結果是否超過控制限以決定失控與否。室間質量評價主要是控制實驗室工作的不準確度，自2000年以來，我國由衛生部臨床檢驗中心開始組織開展臨床流式細胞術室間質評工作，現已開展的項目包括T細胞亞群分析和CD34絕對計數。

【參考文獻】

[1] 崔巍，牛福玲，何麗云，王碩仁.流式細胞術檢測細胞凋亡的分析軟件比較.北京中醫藥大學學報.2001.（6）45-47

[2] 陶德定；冷彥；覃吉超；余源；龔建平.新鮮腫瘤標本活細胞與固定細胞的DNA含量分析比較.癌癥：英文版.200120（5）：502-504

[3] 曾文軍，王柳均，樊翌明，吳志華.細胞凋亡的流式細胞儀檢測技術研究進展[J].醫學文選.2005.24（3）：425-426