Ⅱ型膠原基因型變化與 Legg-perthes病發病的相關性研究

孟海濤，李林，王翠蘋，曾文超，聶志奎，郭洪敏

(山東省濟寧市第一人民醫院骨關節科，山東 濟寧 272011)

Ⅱ型膠原基因型變化與 Legg-perthes病發病的相關性研究

孟海濤，李林，王翠蘋，曾文超，聶志奎，郭洪敏

(山東省濟寧市第一人民醫院骨關節科，山東 濟寧 272011)

目的 使用mRNA探針檢測Ⅱ型膠原基因型的變化，酶聯免疫吸附法檢測血清Ⅱ型膠原抗體濃度，闡明Ⅱ型膠原基因型改變是Legg-perthes病的病因。方法 實驗選用健康雜種幼犬20只(年齡為2個月，相當于人3.5 歲)，雌雄不限，采用自身對照方法，任選一側髖為實驗側，另一側作為對照側，實驗側股骨頸內注射醫用TH膠1 mL制作Legg-Perthes病動物模型，對照側注入生理鹽水1 mL。于注膠后4、8、12周時分批處死取材，采用mRNA探針檢測Ⅱ型膠原基因型及酶聯免疫吸附法檢測血清Ⅱ型膠原抗體濃度。結果 Ⅱ型膠原基因型及血清Ⅱ型膠原抗體濃度測定發現在第8～12周時實驗組與對照組之間均有極顯著性差異(P<0.01)。結論 Ⅱ型膠原基因型的改變可能是Legg-perthes病的病因，可能是因為Ⅱ型膠原刺激產生相應抗體發生特異性免疫反應，導致自身免疫攻擊，參與Legg-perthe病的發病過程。

mRNA探針；醫用TH膠；幼犬；Legg-perthes病

Legg-perthes病，亦稱為兒童股骨頭軟骨炎，是發生于兒童股骨頭局部的自愈性自限性疾病，是骨科領域常見的疑難病之一，嚴重危害兒童的身心健康。其特征是股骨頭缺血及不同程度骨壞死，而骨的壞死與修復又是同時進行的，其自然病程大約需要2～4年，病變愈合后往往遺留不同程度的關節畸形和功能障礙，并可能發展為早期骨性關節炎[1-2]，目前尚無統一的評定標準、早期診斷和治療方法。因此，本研究通過建立幼犬Legg-perthes病模型，觀察Ⅱ型膠原基因型及其血清抗體濃度的變化以探討Legg-perthes病的發病機制。

1 資料與方法

1.1 動物分組 實驗選用健康雜種幼犬20只(年齡為2個月，相當于人3.5 歲)，體重3～5 kg，雌雄不限，采用自身對照方法，任選一側髖為實驗側，另一側作為對照。

1.2 Legg-perthes病模型的建立 所有動物經過適應性喂養2周后開始造模。幼犬腹腔內注藥全麻后，仰臥位固定，無菌操作，實驗側驅血帶驅血后放射監控下應用骨穿刺套針經皮于大轉子下方向股骨頸中央穿刺達股骨頭頸部骺板遠側，注入醫用TH膠1 mL。術后相同條件下分籠飼養，給予充足活動空間，注膠后4周、8周、12周時分批處死取材。

1.3 指標檢測 動物處死后立即取出股骨頭及干骺端，沿冠狀面正中剖開，采用mRNA探針檢測Ⅱ型膠原基因型及酶聯免疫吸附法檢測血清Ⅱ型膠原抗體濃度。

1.4 統計學處理 所有實驗數據由SPSS統計軟件處理。采用獨立樣本t檢驗進行組間比較，各組間差異性檢驗的顯著性水平定為P<0.05。

2 結 果

2.1 Ⅱ型膠原基因型檢測結果 采用mRNA探針檢測Ⅱ型膠原基因型結果顯示，實驗組股骨頭冠狀切面Ⅱ型膠原基因型有明顯改變，而對照組未見該改變。

2.2 血清Ⅱ型膠原抗體濃度 采用酶聯免疫吸附法檢測血清Ⅱ型膠原抗體濃度結果見表1。注射醫用TH膠后4周，Ⅱ型膠原抗體吸光度較對照組增大；8周時Ⅱ型膠原抗體的吸光度較4周時增大；12周時可見對照組的吸光度未見明顯變化，而實驗組的吸光度隨時間不斷增大，且兩者的吸光度比值也逐漸增大。

表1 各組動物血清中Ⅱ型膠原抗體濃度的比較

3 討 論

目前關于Legg-perthes病的發病機理大都局限于局部的血供障礙和脂質代謝障礙出現的脂肪栓塞。最近研究認為Legg-perthes病是一個多種因素共同作用的復雜疾病，Ⅱ型膠原可能是引起Legg-perthes病的原因之一[3]。Ⅱ型膠原主要分布于軟骨和眼的玻璃體中，是關節軟骨的主要組成蛋白。膠原蛋白相當于骨骺的軟組織支架，擔負著骨骺細胞的生長，與其營養供應和細胞間信號的調節密切相關。骨骺中膠原蛋白主要為Ⅱ型膠原，當Ⅱ型膠原出現某種變化時，便會導致軟骨局部穩定的生理環境發生變化，產生相應的軟骨病變，長此以往繼而引起骨質病變[4]。

有研究發現，Ⅱ型膠原是一種組織局限性蛋白，主要存在于關節軟骨和骨骺中，它是關節軟骨的主要組成蛋白。關節損傷或關節內血流受阻時，Ⅱ型膠原釋放入血并刺激免疫系統產生自身免疫攻擊，推測這可能是關節軟骨炎發生機制之一[5]。Miyamoto等[4]報告一個Legg-perthes遺傳特征明顯的家族，家族三代男、女均有發病。對家族10位成員的外周血基因分析發現，編碼Ⅱ型膠原α1鏈的基因變異是引起Legg-perthes的致病因素。Ⅱ型膠原是軟骨細胞增殖、分化過程中合成和分泌的重要膠原，也是關節軟骨細胞的標志分子之一。目前，已經發現很多骨骼系統疾病，如成人股骨頭壞死、早期發生的骨關節炎等均與Ⅱ型膠原基因變異有關[6-7]。最近的研究發現，通過對病變的股骨頭關節軟骨行組織學檢查確定，軟骨組織已經發生了廣范的超微結構異常。組織學結果表明，突變體的軟骨的層次結構和嵌入式的軟骨細胞明顯異常。Ⅱ型膠原的表達和分布在突變體的軟骨部分不均勻，超微結構檢查發現在突變體中的軟骨發生明顯的軟骨細胞和膠原纖維排列紊亂。這說明由于Ⅱ型膠原中的甘氨酸被絲氨酸替代，顯著降低了Ⅱ型膠原的穩定性。研究還表明，在Ⅱ型膠原COL2A1中的p.gly1170ser結構突變引起的關節軟骨結構明顯改變是發生新的膠原基因病的原因[8]。Th免疫應答是此病發生所必需的誘因和主要原因，而且Legg-perthes病的病理變化與之極其相似[9]。與以上研究結果一致，本實驗發現Ⅱ型膠原基因型及血清Ⅱ型膠原抗體濃度在第8～12周時實驗組與對照組之間均有極顯著性差異。由此推測，Ⅱ型膠原基因變異可能是Legg-perthes的致病因素，對Ⅱ型膠原及其血清抗體的進一步研究可為Legg-perthes病早期診治提供理論依據。

Legg-perthes病往往會遺留不同程度的關節畸形和功能障礙，嚴重危害患兒的身心健康。因此，研究Legg-perthes的病因、發生機制具有重要的臨床價值。

[1]Lieberman JR，Berry DJ，Mont MA.Osteonecrosis of the hip：management in the 21st century[J].Instr Course Lect，2003(52)：337-355.

[2]Garnero P1，Charni N，Juillet F，etal.Increased urinary typeⅡcollagen helical and C telopeptide levels are independently associated with a rapidly destructive hip osteoarthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases，2006，65(12)：1639-1644.

[3]Mortier GR，Weis M，Nuytinck L，etal.Report of five novel and one recurrent COL2A1 mutations with analysis of genotype-phenotype correlation in patients with a lethal typeⅡcollagen disorder[J].J Med Genet，2000，37(4)：263-271.

[4]Miyamoto Y，Matsuda T.A recurrent mutation in typeⅡcollagen gene causes Legg-Calv-Perthes disease in a Japanese family[J].Hum Genet，2007，121(6)：625-629.

[5]Gordon JE，Schoenecker PL，Osland JD，etal.Smoking and socioeconomic status in the etiology and severity of Legg-Calve-Pertes disease[J].J Pediatr Orthop B，2004，13(6)：367-370.

[6]Liu YF，Chen WM，Lin YF，etal.TypeⅡcollagen gene variants and inherited osteonecrosis of the femoral head[J].N Engl J Med，2005，352(22)：2294-2301.

[7]Avcjn T，Makjtje O，Susjc M，etal.Early onset osteoarthritis due to otospondylomegaepiphyseal dysplasia in a family with a novel splicing mutation of the COLl1 A2 gene[J].J Rheumatol，2008，35(5)：920-926.

[8]Hresko MT，McDougall PA，Gorlin JB，etal.Prospective reevaluationof the associationbetween thromboticdiathesis and legg-perthesdisease.International Orthopaedics[J].December，2010，34(8)：1333-1339.

[9]Diley A，Hooper WC.The fibrinogen gene G-455-A polymorphism is a risk factor for Legg-Perthes disease[J].J Throm Haem，2005，23(1)：2317-2321.

Changes of Collagen Ⅱ Genotype in Legg-perthes Disease

Meng Haitao，Li Lin，Wang Cuiping，etal

(Department of Joint Sugery，1st People′s Hospital of Jining，Jining 272011，China)

Objective To expore changes of collagen-Ⅱ genotype in Legg-perthes Disease.Methods 20 healthy half-bred young dogs were used.1 ml of TH glue was injected into one hip joint in the experimental group，whereas 1 ml of physiological saline solution was injected into the other hip joint as control.Samples was taken at 4，8 and 12 weeks post injection.mRNA probes was used to detect the collagen genotype changes，and ELISA was used to detect the antibody thickness of collagen-Ⅱ.Results There was an notable difference of collagen-Ⅱ genotype and antibody thickness between the experimental group and the collation group at 8 and 12 weeks post injection (P<0.01).Conclusion The collagen-Ⅱ genotype changes may be one of the causes of Legg-perthes disease.One probable mechamism is that antibody provoked by collagen-Ⅱ lead a immunoreaction and participate in Legg-perthes morbidity process.

mRNA probe；TH glue；young dogs；legg-perthes disease

1008-5572(2015)02-0134-02

R681.8

A

2014-08-25

孟海濤(1976- )，男，主治醫師，山東省濟寧市第一人民醫院骨關節科，272011。