山羊腰椎間盤退變微創(chuàng)動(dòng)物模型研究

謝林，顧軍，唐田，陳艦艦

(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210028)

實(shí)驗(yàn)研究

山羊腰椎間盤退變微創(chuàng)動(dòng)物模型研究

謝林，顧軍，唐田，陳艦艦

(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210028)

目的 腰椎間盤退變動(dòng)物模型是研究人體椎間盤退變的機(jī)制及治療方法中不可或缺的部分，目前腰椎間盤退變模型研究以小型動(dòng)物為主，其椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體差異明顯。山羊腰椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體相似，本研究用微創(chuàng)手術(shù)方法建立山羊腰椎間盤損傷退變模型，探索一種新的大型動(dòng)物腰椎間盤退變?cè)炷７椒?。方?20只成年波爾多山羊隨機(jī)分為腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)。術(shù)前A、B組使用MRI測(cè)量腰椎間盤原始數(shù)值，腰椎微創(chuàng)造模組(A組)使用全內(nèi)窺鏡腰椎微創(chuàng)手術(shù)方法制造腰椎間盤退變模型，腰椎假手術(shù)組使用相同操作而不損傷腰椎間盤。術(shù)后2個(gè)月復(fù)查腰椎MRI，動(dòng)物空氣栓塞處死后獲取腰椎間盤標(biāo)本，并進(jìn)行組織固定、切片、染色。術(shù)前及術(shù)后按Videman椎間盤退變等級(jí)、Zhang Y的山羊動(dòng)物椎間盤組織退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)比較兩組之間腰椎MRI影像學(xué)及細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)評(píng)分，并用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，rt-PCR)法檢測(cè)腰椎間盤髓核組織中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)基因表達(dá)差異。結(jié)果 腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)經(jīng)比較，MRI影像學(xué)評(píng)分差異明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞組織形態(tài)評(píng)分差異明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIF-1基因表達(dá)在兩組之間差異顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NF-κB表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)腰椎間盤MRI及組織形態(tài)學(xué)差異顯著，從影像學(xué)及組織學(xué)上說(shuō)明全內(nèi)窺鏡微創(chuàng)造模法成功建立波爾多山羊腰椎間盤退變動(dòng)物模型。兩組山羊HIF-1、TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達(dá)差異從分子角度證明山羊腰椎間盤退變微創(chuàng)動(dòng)物模型造模成功。

腰椎間盤退變；山羊動(dòng)物模型；微創(chuàng)手術(shù)

腰椎間盤退變引起的相關(guān)病癥影響著人們的生活，而腰椎間盤退變動(dòng)物模型是研究人體椎間盤退變的機(jī)制及治療方法中不可或缺的部分。目前，關(guān)于腰椎間盤退變動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)道較多，備選動(dòng)物種類及動(dòng)物模型制作方法繁多，但以鼠、兔居多，其椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)差異明顯，并且其椎間盤體積較小，不利于椎間盤組織工程修復(fù)、椎間盤細(xì)胞再生等研究，而山羊腰椎間盤解剖結(jié)構(gòu)與人體較為相似。本研究用腰椎微創(chuàng)手術(shù)方法建立腰椎間盤退變模型，探索一種新的大型腰椎間盤退變動(dòng)物造模方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材與動(dòng)物造模 選用20只健康雌性成年波爾多山羊(江蘇省農(nóng)科院羊養(yǎng)殖基地提供)，體重36～41 kg，平均為38.5 kg，采用隨機(jī)數(shù)列分為2組，每組10只，分別為腰椎微創(chuàng)造模組(A組)、腰椎假手術(shù)組(B組)。

實(shí)驗(yàn)器材：德國(guó) Richard Wolf全內(nèi)窺鏡操作系統(tǒng)(25°視角，長(zhǎng)度165 mm，直徑6.9 mm×5.6 mm，工作通道直徑4.1 mm)、常規(guī)骨科手術(shù)器械、德國(guó)Richard Wolf胸腰椎全內(nèi)窺鏡脊柱手術(shù)器械(抓鉗、籃鉗、探針)、美國(guó)KARL STORZ視頻影像系統(tǒng)、德國(guó)Richard Wolf手術(shù)沖洗泵系統(tǒng)、西門子公司C型移動(dòng)式X線機(jī)、Ellman美國(guó)雙頻射頻機(jī)(4 MHz)、美國(guó)Thermo Scientific公司702型超低溫冰箱、日本Sanyo公司MPR-1410恒溫保存箱、日本Sanyo公司MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋、Eppendorf 5415D小型臺(tái)式高速離心機(jī)、美GE核磁共振成像儀、3L袋裝生理鹽水(每袋鹽水中加入慶大霉素16萬(wàn)單位)。美國(guó)Milli-Q Biocel超純水器-2.5 mm克氏針數(shù)枚。術(shù)前常規(guī)骨科器械采用高溫消毒，全內(nèi)窺鏡脊柱手術(shù)器械采用低溫消毒。

實(shí)驗(yàn)藥品及試劑：速眠新Ⅱ(10*1.5 mL，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn))、鹿醒寧(10*1.5 mL，吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn))、鹽酸利多卡因(5 mL︰100 mg，山東華魯制藥有限公司提供)、注射用青霉素納(160萬(wàn)單位，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))、10%中性甲醛(江蘇省中醫(yī)藥研究院病理科配制)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司生產(chǎn))、氯仿(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、異丙醇(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、Trizol(Invitrogen公司生產(chǎn))、75%酒精(西隴化工股份有限公司生產(chǎn))、SBYR Green預(yù)混試劑(Thermo公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)前一天開(kāi)始禁食，術(shù)前肌注陸眠寧Ⅱ(0.2 mL/kg)(長(zhǎng)春軍需大學(xué)研究所提供)行全身麻醉。麻醉成功后，進(jìn)行MRI術(shù)前檢查，記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腰椎基礎(chǔ)信號(hào)。腰椎手術(shù)區(qū)域備皮，造模組取左側(cè)臥位，常規(guī)手術(shù)消毒、鋪巾，C型臂機(jī)下定位L3～4及L4～5椎間隙，連接雙頻射頻機(jī)、全內(nèi)窺鏡、視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、及手術(shù)沖洗泵系統(tǒng)。自L3～4，L4～5椎體前外側(cè)用皮刀切開(kāi)約0.6 cm切口，垂直插入開(kāi)路錐，經(jīng)C型臂機(jī)透視正側(cè)位確定位置后，逐漸向椎間盤垂直插入套筒，C型臂機(jī)透視再次確認(rèn)位置后放置全內(nèi)窺鏡工作系統(tǒng)，在視頻監(jiān)視下用射頻探頭止血并燒灼阻礙視野的脂肪組織，顯露椎間盤，以探針探入，證實(shí)是椎間盤后將2.5 mm克氏針插入，用榔頭緩慢敲入1 cm，拔除克氏針，徹底止血，拔除套筒，縫合切口，敷料覆蓋，術(shù)畢。腰椎微創(chuàng)造模組(A)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)中出血少，手術(shù)過(guò)程順利。腰椎假手術(shù)組(B組)手術(shù)過(guò)程無(wú)克氏針損傷椎間盤步驟，其余與造模組相同。

各組實(shí)驗(yàn)羊蘇醒后均能自行行走，生命體征穩(wěn)定，四肢活動(dòng)正常，術(shù)后6 h后予正常飲食，肌注青霉素80萬(wàn)U，連續(xù)3 d。術(shù)后密切觀察切口滲血滲液、飲食、四肢活動(dòng)及大小便情況，切口處紅霉素軟膏預(yù)防感染。

1.2 標(biāo)本處理與檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及制備 兩組60 d后，在全麻下再次對(duì)實(shí)驗(yàn)羊的腰椎攝MRI，與術(shù)前的MRI進(jìn)行比較，取耳緣靜脈予空氣栓塞處死，取出完整腰椎，剔除椎體周圍肌肉、韌帶，保留L1～L6椎體。截取包括腰椎間盤及其兩側(cè)1/3椎體，祛除兩側(cè)椎弓根、椎板及周圍軟組織，取部分椎間盤標(biāo)本以10%中性甲醛浸泡，固定1 周后，然后用10%稀硝酸常溫下脫鈣，脫鈣至針尖能扎進(jìn)終板為準(zhǔn)。脫鈣后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟塊包埋，切片機(jī)切片，切片后行HE染色。剩余椎間盤標(biāo)本30 min內(nèi)放入-80℃冰箱內(nèi)保存以備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)用。

1.2.2 MRI評(píng)估 由兩位不參與手術(shù)的骨科醫(yī)生和兩位放射科醫(yī)生進(jìn)行腰椎間盤退變程度MRI檢測(cè)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物羊術(shù)前、術(shù)后2個(gè)月腰椎矢狀位、冠狀位、水平位MRI檢測(cè)對(duì)比，并計(jì)算Kappa值。根據(jù)Videman椎間盤退變等級(jí)對(duì)腰椎間盤的退變程度進(jìn)行評(píng)估(見(jiàn)表1)。

表1 Videman椎間盤退變等級(jí)

1.2.3 組織學(xué)評(píng)估 根據(jù)Zhang Y的山羊動(dòng)物椎間盤退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表2)從四方面評(píng)估椎間盤退變程度：a)纖維環(huán)與髓核交界處結(jié)構(gòu)；b)纖維環(huán)組織結(jié)構(gòu)；c)髓核組織外基質(zhì)形態(tài)；d)髓核細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)。分?jǐn)?shù)為0-2分，正常組織為0分，輕微退變?yōu)?分，重度退變?yōu)?分。觀察切片的顯微鏡為Olympus BX-60。

表2 Zhang Y的山羊動(dòng)物椎間盤退變分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 基因表達(dá)檢測(cè)

1.2.4.1 RNA的提取 所有實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)雙蒸餾水清洗，高溫蒸汽消毒，烘箱烘烤24 h處理。迅速剪碎取出的新鮮髓核組織標(biāo)本，在研磨皿中加入適量液氮，待液氮揮發(fā)后，用研磨棒將髓核組織剪碎。加入TRIzol試劑1 mL(組織塊總體積未超過(guò)TRIzol試劑體積的10%)，用移液槍頭充分吹打該髓核組織樣品，移入1.5 mL EP管中，將上述EP放置室溫下5 min，等待核糖核酸和蛋白分離充分，再向每1 mLTRIzol試劑用量的勻漿液中加入0.2 mL氯仿，蓋緊管蓋，后手動(dòng)劇烈搖晃15 s，溶液呈乳粉紅色狀，無(wú)分層現(xiàn)象。最后室溫靜置2～3 min，放入4℃離心機(jī)，于 10 000 rpm離心10 min；取出EP管，見(jiàn)樣品分為三層：無(wú)色清水相的上層、乳白色的中間層及粉紅色的有機(jī)相下層。只吸取上層水相(無(wú)色)加入到新EP管中，吸入約200 μL；不必過(guò)多吸取上清液，防止吸入DNA和蛋白雜質(zhì)(中間層，白色)；上清液加入200 μL的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻；于室溫下靜置10 min，待RNA充分沉淀(為減少RNA降解，此步驟可省略)再次將混合溶液放入4℃離心機(jī)，于 10 000 rpm離心10 min；離心后，本次將上清棄除(注意不丟棄沉淀)，每管加入1 mL 75%乙醇潤(rùn)洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動(dòng)試管，以去除殘留的異丙醇和鹽份，于4℃離心機(jī)下7 500 rpm離心5 min；將上清棄除(注意不丟棄沉淀)，打開(kāi)管蓋，將RNA沉淀干燥(室溫?fù)]發(fā))，未讓RNA沉淀不可完全干燥，否則難以溶解；將RNA沉淀溶解于50 μL的無(wú)酶(RNase)水中，待完全溶解后取少量進(jìn)行電泳和OD值檢測(cè)，后于-80℃保存。

1.2.4.2 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)查閱NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)資料，獲得腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase，MMP-1)五個(gè)基因的序列，設(shè)計(jì)quantitative real time PCR引物。引物設(shè)計(jì)軟件：Primer5。引物設(shè)計(jì)如下：

NF-kB

Goat-NF-KB-F：5-GACACAGCCAGTTACATGTGC-3′

Goat-NF-KB-R：5-TGGCCCGGATGAATACTTGG-3′

TNF-α

Goat-TNF-α-F：5-CAGACATCCCATTCAGGAGGC-3′

Goat-TNF-α-R：5-GTGTTTTGCACTTTTGTCCTGC-3′

Bcl-2

Goat-Bcl-2-F 5-GTCTGAAGCGCATCGGAGAT-3′

Goat-Bcl-2-R 5-CCTTGAGCACCAGTTTGCTG-3′

HIF-1

Goat-HIF-1-F 5-TCCATTTTCCACTCAGGACACT-3′

Goat-HIF-1-R 5-GCGGTGGCTATAGGAGGTTC-3′

MMP-1

Goat-MMP-1-F 5-TGGGCGAGTATGCCACATTT-3′

Goat-MMP-1-R 5-TCCTGAGCTCCTCGTTGAAA-3′

GAPDH

Goat-GAPDH-F 5-CATGTTTGTGATGGGCGTGA-3′

Goat-GAPDH-R 5-GTGGTCATAAGTCCCTCCACG-3′

2 結(jié) 果

2.1 腰椎間盤退變影像學(xué)結(jié)果 造模前后MRI腰椎間盤纖維環(huán)形態(tài)見(jiàn)圖1～2。腰椎微創(chuàng)造模組與腰椎假手術(shù)組在術(shù)后2個(gè)月腰椎間盤的MRI結(jié)果相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3 各組實(shí)驗(yàn)羊L3～4、L4～5腰椎間盤影像學(xué)評(píng)分測(cè)量結(jié)果比較(例)

圖1 造模前MRI示右側(cè)纖維結(jié)構(gòu)完整

2.2 腰椎間盤退變組織學(xué)結(jié)果 兩組髓核組織形態(tài)(400倍光鏡下觀察)見(jiàn)圖3～4。兩組實(shí)驗(yàn)羊L3～4、L4～5腰椎間盤組織學(xué)評(píng)分測(cè)量，腰椎微創(chuàng)造模組(10 例)組織學(xué)評(píng)分(1.50±0.40)分，腰椎假手術(shù)組(10 例)組織學(xué)評(píng)分(0.10±0.05)分，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 造模后MRI示右側(cè)纖維結(jié)構(gòu)紊亂

圖3 腰椎假手術(shù)組髓核細(xì)胞豐富，胞漿均勻，胞核形態(tài)正常(×400)

圖4 腰椎微創(chuàng)造模組髓核細(xì)胞減少，髓核細(xì)胞形態(tài)異常，胞漿減少，胞核濃縮(×400)

2.3 腰椎間盤退變TNF-α、Bcl-2、HIF-1等基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，HIF-1基因表達(dá)在兩組之間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TNF-a、TGF-β、IL-1基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NF-κB表達(dá)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表4)。

3 討 論

腰椎間盤退變繼發(fā)的椎間盤源性腰痛、腰椎間盤突出癥及相關(guān)運(yùn)動(dòng)功能障礙普遍存在。70%的人一生中會(huì)因?yàn)檠甸g盤退變引起的疾病就診[1]。20世紀(jì)60年代起國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始對(duì)腰椎間盤退變的病因、病理進(jìn)行研究，其確切的退變機(jī)理仍不清楚。眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為腰椎間盤退變是多種因素共同作用的結(jié)果，包括氧化應(yīng)激、炎癥因子、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、酶活性水平的改變、營(yíng)養(yǎng)通路等因素，在退變過(guò)程中腰椎間盤的生物力學(xué)、生物化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了相應(yīng)的變化，最終導(dǎo)致腰椎間盤細(xì)胞分解代謝增加，合成代謝減少，導(dǎo)致腰椎間盤退變。

表4 各組實(shí)驗(yàn)羊腰椎間盤組織基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果

3.1 建立動(dòng)物模型的意義 動(dòng)物模型是研究人體腰椎間盤退變的機(jī)制及治療方法中不可或缺的部分。鑒于目前研究方法與治療手段的多樣性，為探索腰椎間盤退變的發(fā)病機(jī)制及藥物的治療機(jī)制，需要獲得與人體椎間盤結(jié)構(gòu)及退變機(jī)制相似的動(dòng)物模型，并且這種模型需要滿足經(jīng)濟(jì)性、低周期性、易獲得性、可重復(fù)性等特點(diǎn)。但目前研究動(dòng)物使用種類繁雜，模型制作的方式多種多樣，沒(méi)有固定的造模標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有統(tǒng)一的評(píng)估體系。因此，建立經(jīng)濟(jì)、安全、可靠的腰椎間盤退變動(dòng)物模型，用于研究腰椎間盤退變的發(fā)生、發(fā)展以及探索其有效治療手段以及制定防治策略具有重要意義。目前，腰椎間盤退變動(dòng)物模型主要有自發(fā)退變模型[2-4]、損傷動(dòng)物模型[5-7]、誘導(dǎo)退變模型等[8-10]，它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，而微創(chuàng)腰椎間盤退變?cè)炷Ｊ悄壳把芯康臒狳c(diǎn)。

3.2 構(gòu)建動(dòng)物模型的方法選擇 動(dòng)物模型是研究人體椎間盤退變的機(jī)制及治療方法中不可或缺的部分。但是選擇動(dòng)物模型模擬人體的腰椎間盤退變過(guò)程時(shí)，要考慮到動(dòng)物的種類、自然壽命、年齡、行走方式等，同時(shí)也要考慮到人體的生理構(gòu)成，考慮到人體椎間盤在正常生理狀態(tài)下所承受著垂直方向的重力及水平方向的剪切力特征。出于上述考慮，類人猿如恒河猴是最理想的動(dòng)物模型之一，但由于經(jīng)濟(jì)成本、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲取等因素，此類動(dòng)物模型不能成為主要的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

小動(dòng)物，諸如嚙齒類大鼠、兔是目前常用的備選動(dòng)物。此類動(dòng)物容易獲得、造模周期短、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，所以被廣泛用于椎間盤退變研究。但是此類動(dòng)物椎間盤較小，普通的注射穿刺即可引起退變，所以只適用于前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，不利于藥物注射、細(xì)胞移植、基因轉(zhuǎn)染的椎間盤再生、修復(fù)的研究。大型動(dòng)物的椎間盤結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)較為相似，其中包括犬類、豬、牛、羊等大型動(dòng)物。O′Connell等[11]使用幾何方法研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物椎間盤厚度、高度、前后徑等與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似度發(fā)現(xiàn)，大型動(dòng)物山羊的椎間盤結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)較為相似。

在選擇以何種方式構(gòu)建動(dòng)物退變模型時(shí)，自然退變模型、椎間盤損傷模型、誘導(dǎo)模型是目前主要的備選方案。自然退變的動(dòng)物模型與人體腰椎間盤退變過(guò)程相似，但模型獲取周期較長(zhǎng)，嚙齒類動(dòng)物如大鼠就需要8到9個(gè)月時(shí)間，大型動(dòng)物需要的時(shí)間更長(zhǎng)，此類動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)是其缺點(diǎn)。目前纖維環(huán)損傷模型應(yīng)用較廣，大量報(bào)道顯示損傷后的椎間盤組織退變較快，模型容易獲得，但其缺點(diǎn)主要是在手術(shù)方法上的不足，因?yàn)殚_(kāi)放手術(shù)對(duì)腰椎間盤周圍組織損傷較大，安全性低、死亡率高，增加了造模風(fēng)險(xiǎn)與不必要的干擾因素。誘導(dǎo)模型主要研究單一致病因素或者生存環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的椎間盤退變影響，不利于廣泛的機(jī)制及治療方法的研究。所以，能夠重復(fù)、安全、創(chuàng)傷小、經(jīng)濟(jì)、能夠模擬的大型動(dòng)物模型是目前腰椎間盤退變研究所缺少的。

我們使用與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似的山羊作為備選動(dòng)物，通過(guò)腰椎間盤微創(chuàng)技術(shù)制備山羊腰椎間盤退變模型，在充分使用大型動(dòng)物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)同時(shí)，減少造模過(guò)程所帶來(lái)的損傷因素、結(jié)構(gòu)破壞的干擾因素，為腰椎間盤退變提供可重復(fù)且簡(jiǎn)單易行的動(dòng)物模型方法，為日后腰椎間盤修復(fù)及再生準(zhǔn)備理想的動(dòng)物模型。

3.3 動(dòng)物模型制備的要求 腰椎間盤退變模型的選擇要考慮多方面因素，獲得理想腰椎間盤退變模型要綜合以下因素：a)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)實(shí)用、獲取方便、有利于廣泛開(kāi)展研究；b)腰椎間盤退變模型可重復(fù)性好，安全可靠；c)選擇造模動(dòng)物的腰椎間盤結(jié)構(gòu)與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似，有利于開(kāi)展進(jìn)一步的修復(fù)與再生研究；d)造模動(dòng)物的退變過(guò)程應(yīng)與人體的損傷及自然退變過(guò)程相似；e)造模動(dòng)物損傷可控與精確化，減少不必要的手術(shù)損傷與退變的干擾因素；f)構(gòu)建腰椎間盤退變客觀、統(tǒng)一的量化標(biāo)準(zhǔn)，減少人為的主觀因素對(duì)腰椎間盤退變的干擾。

所以采用大型動(dòng)物作為備選動(dòng)物模型，借助腰椎微創(chuàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)腰椎間盤結(jié)構(gòu)損傷的可控性、精確性，是以后腰椎間盤退變模型構(gòu)建的研究方向，但目前客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，需進(jìn)一步量化微創(chuàng)動(dòng)物模型的觀察及測(cè)量指標(biāo)。

[1]Andersson GB.Epidemiological features of chronic low-back pain.Lancet[J].The Lancet，1999，354(9178)： 581-585.

[2]Bergknut N，Rutges JP，Kranenburg HJ，etal.The dog as an animal model for intervertebral disc degeneration?[J].Spine (Phila Pa 1976)，2012，37(5)：351-358.

[3]Cho H，Park SH，Lee S，etal.Snapshot of degenerative aging of porcine intervertebral disc：a model to unravel the molecular mechanisms[J].Exp Mol Med，2011，43(6)：334-340.

[4]Zhang Y，Sun Z，Liu J，etal.Features of intervertebral disc degeneration in rat′s aging process[J].J Zhejiang Univ Sci B，2009，10(7)：522-527.

[5]Xi Y，Kong J，Liu Y，etal.Minimally invasive induction of an early lumbar disc degeneration model in rhesus monkeys[J].Spine (Phila Pa 1976)，2013，38(10)：E579-586.

[6]Michalek AJ，Iatridis JC.Height and torsional stiffness are most sensitive to annular injury in large animal intervertebraldiscs[J].Spine J，2012，12(5)：425-432.

[7]Zhang W，Li T，Gong Q，etal.A comparative study on establishing rabbit intervertebral disc degeneration models by three methods[J].Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi，2010，24(1)：41-45.

[8]Wang D，Nasto LA，Roughley P，etal.Spine degeneration in a murine model of chronic human tobacco smokers[J].Osteoarthritis Cartilage，2012，20(8)：896-905.

[9]Liang QQ，Zhou Q，Zhang M，Prolonged upright posture induces degenerative changes in intervertebral discs in rat lumbar spine[J].Spine (Phila Pa 1976)，2008，33(19)：2052-2058.

[10]朱偉紅，朱海波，馬南，等.山羊腰椎間盤退變模型硬膜外膠原酶的注射[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(26)：4751-4754.

[11]O′Connell GD，Vresilovic EJ，Elliott DM.Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry[J].Spine，2007，32(3)：328-333.

An Animal Goat Model of Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Using Minimally Invasive Surgery

Xie Lin，Gu Jun，Tang Tian，etal

(Jiangsu Provincial Hospital of TCM and Western Medicine，Nanjing 210028，China)

Objective To make goat model of lumbar intervertebral disc degeneration to explorer a new method to create large animal model.Methods Twenty Bordeaux goats were divided to two groups.Group A underwent full-endoscopic technique of minimally invasive surgery，the group B is sham-operation group.Original dates of all lumbar intervertebral disc were detected by MRI before operation.Full-endoscopic technique of minimally invasive surgery was used to make animal model of lumbar intervertebral disc degeneration.Sham-operation group accape the same technique but the structure of lumbar intervertebral disc was not injured.Two months later，MRI test was taken again and lumbar intervertebral discs were harvested after animals sacrificed.Comparation of MRI scores，histology scores and gene expression including HIF-1、TNF-a、TGF-β、NFκB、IL-1in nucleus pulposus tissue were taken in these two groups.Results There were statistically significant differences in MRI scores and histology scores of these two groups(P<0.05).TNF-a、TGF-β、IL-1 gene expression also had a significant difference in these two groups，further more the gene expression of HIF-1 had a statistically significant difference(P<0.01).The gene expression of TNF-a between group A and group B had no statistically difference.(P>0.05)Conclusion The statistically significant differences in MRI scores and histology scores illustrate that full-endoscopic technique of minimally invasive surgery successfully estabilish a goat model of lumbar intervertebral disc degeneration.Also the significant different gene expression of HIF-1、TNF-a、TGF-β、IL-1in nucleus pulposus tissue of the two groups further prove this conclusion with molecule evidence.

lumbar intervertebral disc degeneration；goat animal model；minimally invasive surgery

江蘇省衛(wèi)生國(guó)際交流支撐計(jì)劃及江蘇省中醫(yī)藥局領(lǐng)軍人才項(xiàng)目資助(BZ2008071)；江蘇省生命健康科技專項(xiàng)(BL2012069)

1008-5572(2015)08-0709-05

R332

A

2014-12-10

謝林(1965- )，男，主任醫(yī)師，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科，210028。