小菜蛾ABCG2 mRNA表達特征及茚蟲威對其表達量的影響

朱 航, 王雅菲, 周小毛,2*

(1.湖南農業大學農藥研究所,長沙 410128;2.湖南省農業科學院,長沙 410125)

小菜蛾ABCG2 mRNA表達特征及茚蟲威對其表達量的影響

朱 航1, 王雅菲1, 周小毛1,2*

(1.湖南農業大學農藥研究所,長沙 410128;2.湖南省農業科學院,長沙 410125)

采用實時熒光定量RT-PCR技術,測定了小菜蛾不同發育階段、4齡幼蟲不同組織ABCG2 m RNA相對表達量的差異,并進一步檢測了茚蟲威的LC50劑量對小菜蛾3齡幼蟲ABCG2 m RNA表達量的影響。結果表明,不同發育階段小菜蛾ABCG2 mRNA相對表達量在雄性成蟲中最高,明顯高于其他幾個發育階段,分別是3齡的5.63倍、4齡的3.67倍、蛹期的7.36倍、雌蟲的3.51倍。4齡幼蟲的ABCG2 mRNA在中腸中的表達量最高,分別是馬氏管、精巢、殘余體的3.12倍、8.96倍、7.33倍,在頭和表皮的表達量最低;使用茚蟲威的LC50濃度處理小菜蛾3齡幼蟲后,ABCG2 mRNA的表達量逐步上升。研究結果為進一步探究茚蟲威在小菜蛾體內的代謝與ABCG2之間的關系提供一定的參考。

小菜蛾; 茚蟲威; ABCG2 mRNA; 熒光定量PCR

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]屬鱗翅目(Lepidoptera),菜蛾科(Plutellidae),一年發生多代,其繁殖率高,世代重疊現象嚴重,是鱗翅目昆蟲中分布最廣泛的害蟲[1]。盡管人們做了大量工作制定和完善小菜蛾的綜合防治策略[23],但由于小菜蛾本身繁殖很快,加上全球范圍內大量使用農藥,加快了對其抗藥性的選擇[4],導致小菜蛾對多種類型的農藥產生了抗性并且抗藥性越來越強,成為嚴重危害十字花科蔬菜作物的一種世界性害蟲。茚蟲威(indoxacarb)是由美國杜邦公司開發的二嗪類殺蟲劑,由于其作用機制獨特,對鱗翅目害蟲具有卓越的殺蟲活性,且對非靶標生物安全,成為替代有機磷類和擬除蟲菊酯類殺蟲劑防治鱗翅目害蟲的理想品種[5-7]。ABC轉運蛋白全稱為ATP結合盒膜轉運蛋白(ATP-binding cassette transporters),是一大類跨膜轉運蛋白,共分7個亞家族(ABCA～ABCG),它們能夠利用水解ATP產生的能量介導多種生物分子在細胞內外的運輸[8],降低細胞內生物分子的濃度,目前在醫學領域研究比較多。多項報道稱ABC基因家族的B、C、G亞族有介導藥物轉運的能力[9-12],例如,P-糖蛋白(基因符號ABCB 1)、MRP1(基因符號ABCC1)、MRP2(基因符號ABCC2)和BCRP(基因符號ABCG2)跟藥物抗藥性有關,它們能夠將有毒的外源物代謝并運送到細胞外[13]。鑒于ABC轉運蛋白的重要性,研究者對一些昆蟲,如果蠅、家蠶、粉紋夜蛾等體內的部分ABC轉運蛋白進行了研究。Labbé等從粉紋夜蛾和家蠶中分別獲得B、C、G亞族的8、6、13條基因,分析了鱗翅目昆蟲對殺蟲劑等外源化合物的抗性,指出ABC轉運蛋白可能起到顯著的作用[14]。近年來,有報道稱ABCC2與ABCB1分別與小菜蛾對Bt和阿維菌素的抗性相關[15-16]。目前,已報道的昆蟲ABCG2還很有限。ABCG2是一種半轉運體,包括一個跨膜區域(transmembrane domain,TMD)和一個核酸結合區域(nucleotide-binding domain,NBD),是全轉運體ABCB1、ABCC1、ABCC2結構域的一半,盡管與ABCB1、ABCC1和ABCC2在結構域上存在差異,但是在對藥物的抗性中是同時發生作用的[14]。本試驗比較了小菜蛾不同發育階段ABCG2 m RNA相對表達量的差異,分析了4齡幼蟲不同組織中的ABCG2 mRNA相對表達量的差異,以及茚蟲威處理對ABCG2 mRNA相對表達量的影響,以期為以后研究茚蟲威在小菜蛾體內代謝與ABCG2的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試昆蟲

小菜蛾敏感種群由湖南省農業科學院植物保護研究所提供,在溫度為(28±1)℃,相對濕度60%～70%,光周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候箱中用人工飼料喂養11代。成蟲則以15%的蜂蜜水進行飼喂。

1.1.2 主要試劑和儀器

ABI 7300 Real Time PCR儀(美國ABI公司); GZ-800-GSI人工氣候箱,韶關市廣智科技設備有限公司;茚蟲威原藥(indoxacarb,95%)上海悅聯化工有限公司提供;RNA提取試劑TRIzol由美國Invitrogen公司生產;TransScriptTMAll-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for PCR(AT 321),購自北京全式金生物技術有限公司;SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同發育期小菜蛾材料的準備

選取小菜蛾1～4齡幼蟲以及蛹、雌性成蟲、雄性成蟲各3頭,用液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用,每個發育期4個生物學重復。

1.2.2 小菜蛾4齡幼蟲不同組織部位材料的準備

在PBS緩沖液中解剖20頭健康的4齡小菜蛾幼蟲,獲得小菜蛾的頭、表皮、中腸、馬氏管、精巢和其他殘余物,將各組織在PBS緩沖液中清洗3次,然后用液氮速凍,保存于-80℃冰箱中備用,每5頭幼蟲一組,每種組織包括4個生物學重復的樣本。

1.2.3 茚蟲威處理小菜蛾

為了檢測在茚蟲威刺激下,小菜蛾ABCG2在轉錄水平上的反應,將直徑為6 cm的甘藍葉片在0.43 mg/L茚蟲威(該濃度為對敏感種群3日齡3齡幼蟲的LC50)溶液中浸漬10 s,對照為不經藥物處理的葉片,晾干后放置在底部鋪有潤濕濾紙的培養皿中,接入饑餓2 h的小菜蛾3齡幼蟲,每皿20頭活蟲,放入人工氣候培養箱中,在溫度(28± 1)℃,相對濕度60%～70%,光周期L∥D=16 h∥8 h下,分別喂養24、48、72 h,每個處理4個生物學重復,挑出存活的幼蟲用液氮迅速冷卻,放入-80℃冰箱中保存備用。

1.2.4 小菜蛾總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

按照TRIzol(Invitrogen)試劑說明中的步驟分別提取不同齡期以及經茚蟲威處理的小菜蛾總RNA和不同組織的RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,利用核酸檢測儀檢測RNA的純度,合格后使用TransScriptTMAll-in-One First-Strand c DNA Synthesis Super Mix for PCR將RNA反轉錄合成cDNA第一鏈,產物于-20℃下保存備用。

1.2.5 引物的設計與合成以及內參基因的選擇

根據小菜蛾基因組中的ABCG2基因序列設計特異性引物G2YG-F和G2YG-R(表1),引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。將反轉錄獲得的小菜蛾cDNA按10倍梯度稀釋(1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000)后作為模板,通過實時熒光PCR對引物的擴增效率進行檢測,引物的擴增效率為96%符合定量試驗要求。近幾年研究表明,在實時熒光定量試驗中,不同處理條件下的內參基因的表達存在一定的差異,所以,針對處理條件的不同,應選用相應條件下表達更穩定的內參基因[17]。因此本文在研究不同發育期、不同組織以及在茚蟲威LC50濃度處理條件下ABCG2 mRNA表達量試驗中,選用內參基因為延伸因子(elongation factor 1, EF1)、核糖體蛋白L32(ribosomal protein L32, RPL32)和核糖體蛋白S23(ribosomal protein S23, RPS23),詳細信息見表1。

表1 本試驗中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 實時熒光定量PCR

按照Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)試劑盒說明進行加樣,然后將樣品置于ABI 7300 Real Time PCR儀進行擴增反應。擴增程序設置：95℃15 min;95℃10 s,55℃20 s,72℃31 s,40個循環。每個樣品設置4個獨立的生物學重復,每個生物學重復設置4個技術重復。

1.3 試驗數據的統計與分析

采用2-ΔΔCt法進行定量分析,其中ΔΔCt= (Ct目的基因-Ct內參基因)處理-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照,通過SPSS軟件進行差異顯著性分析,LSD法進行多重比對,圖表用Sigmaplot 12.0軟件制作。

2 結果與分析

2.1 ABCG2 mRNA在不同發育階段的相對表達量

根據圖1所示可以看出,小菜蛾ABCG2 mRNA在不同發育階段的相對表達量存在一定的差異。其中在雄性成蟲中表達量最高,分別是3齡幼蟲的5.63倍、4齡的3.67倍、蛹期7.36倍、雌蟲的3.51倍。幼蟲期ABCG2 mRNA的表達量隨齡期增加無顯著差異。

圖1 ABCG2 mRNA在小菜蛾不同發育階段的相對表達量Fig.1 Relative expression quantities of ABCG2 mRNA at different developmental stages of Plutella xylostella

2.2 ABCG2 mRNA在4齡幼蟲不同組織中的相對表達量

從圖2可看出,小菜蛾4齡幼蟲ABCG2 mRNA在中腸、馬氏管、精巢、殘余體相對表達量各不相同。其中在中腸中的相對表達量最高,分別是馬氏管、精巢、殘余體的3.12、8.96、7.33倍,ABCG2 mRNA在頭和表皮的表達量很低。

圖2 ABCG2 mRNA在不同組織的相對表達量Fig.2 Relative expression quantities of ABCG2 mRNA in different tissues

2.3 茚蟲威處理對ABCG2 mRNA相對表達量的影響

如圖3所示,在茚蟲威的刺激下,小菜蛾3齡幼蟲ABCG2 mRNA在轉錄水平呈現出相應的反應,表現為隨處理時間增加表達量上升,而且在處理1、2、3 d時,表達量分別為同齡期無任何藥劑處理組(處理方法同1.2.3)的2.16、4.32、6.76倍。

圖3 茚蟲威處理后ABCG2 mRNA的相對表達量Fig.3 Relative expression of ABCG2 mRNA after treatment with indoxacarb

3 討論

越來越多的研究者意識到在實時熒光定量分析中使用1個內參基因容易產生系統誤差,所以為了減少計算結果的系統誤差,應選用2～3個內參基因,因此本試驗選用了在生物因子和非生物因子條件下都表現出良好穩定性的3個內參基因EF1、 RPL32和RPS23。ABCG2在小菜蛾不同發育階段的表達模式與煙芽夜蛾體內ABC蛋白基因相似[18],有報道稱鱗翅目家蠶體內幾種起代謝解毒作用的基因存在性別上的差異,這些基因在雌雄個體間表達量的差異導致代謝解毒能力在性別間存在差異[19]。本試驗發現ABCG2 m RNA在小菜蛾雌雄個體間的表達量也存在差異,由于目前ABC類轉運蛋白在鱗翅目昆蟲中研究較少,所以該基因在雌雄個體間差異表達的原因有待進一步研究。小菜蛾ABCG2 mRNA在4齡幼蟲的不同組織均有表達,其中在中腸的相對表達量最高,其次是馬氏管,這與在家蠶中的研究結果一致[20]。而且,粉紋夜蛾幼蟲的中腸、馬氏管中與ABCG2基因功能相近的ABCB 1基因的表達量很高[21]。這可能是由于中腸是昆蟲十分重要的消化和吸收器官,馬氏管是重要的排泄器官,這兩個器官都跟外源物質的吸收和代謝有關,所以這兩個部位ABCG2的高表達表明ABCG2可能在外源物質茚蟲威的轉運、吸收、代謝中起到一定的作用。生物體通過復雜的解毒系統來保護機體免受外源有毒物質的侵害。在代謝抗性中,有多種酶參與將有毒物質降解為低毒產物并促進產物排出機體外[22]。ABC跨膜轉運蛋白可以自主結合有毒物質并將其轉運出細胞。Tapadia等研究發現黑腹果蠅經過秋水仙素處理后,P-糖蛋白(ABCB 1)基因被誘導呈現高表達[21]。有報道稱黑腹果蠅在高劑量的MRP的底物甲氨蝶呤毒素作用下, MRP1(基因符號ABCC1)直系同源物d MRP1被誘導高表達[23]。本試驗也發現在茚蟲威的刺激下,小菜蛾的ABCG2在轉錄水平呈現為表達量上升,而且,隨著處理時間的增加,表達量不斷升高,表明ABCG2對茚蟲威刺激存在應激反應。這可能是因為小菜蛾的ABCG2參與了茚蟲威在小菜蛾體內的轉運,被茚蟲威誘導所致,使其解毒代謝功能發揮了相應的作用。

本研究結果可為研究茚蟲威在小菜蛾體內的代謝與ABCG2之間的關系提供參考,下一步可通過RNAi技術開展基因功能驗證的工作,進一步研究ABCG2與昆蟲抗藥性之間的關系。

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(責任編輯：楊明麗)

Characteristics of mRNA relative expression of ABCG 2 in Plutella xylostella and the effect of indoxacarb on its expression

Zhu Hang1, Wang Yafei1, Zhou Xiaomao1,2

(1.Institute of Pesticide Science,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410125,China)

q RT-PCR was used to determine the expression of ABCG 2 m RNA at different developmental stages of Plutella xylostella(L.)and in different tissues of its 4th-instar larvae.And influence of LC50of indoxacarb on expression of ABCG 2 m RNA in the 3rd-instar larvae was also investigated.The results showed that the expression of ABCG 2 m RNA in male adults of P.xylostella was significantly higher than those in other stages,which was 5. 63,3.67,7.36 and 3.51 times of that in the 3rd-,4th-instar larvae,the pupal stage,and the female adults,respectively.In different tissues of the 4th-instar larvae,the mid-gut had the highest expression,which was 3.12, 8.96 and 7.33 times of that in the Malpighian tubule,testis and carcass,respectively.The expression of ABCG 2 m RNA in the head and integument were the lowest.To further identify the effect of indoxacarb on ABCG 2 m RNA,the relative expression of ABCG 2 mRNA in 3rd-instar larvae treated by indoxacarb was also analyzed.The results suggested that the expression of ABCG 2 increased gradually over time.The results are helpful for further study of the relationship of ABCG2 expression and indoxacarb resistance in P.xylostella.

Plutella xylostella; indoxacarb; ABCG 2 mRNA; q RT-PCR

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.021

2014-11-05

2015-02-10

國家自然科學基金項目(31371966)

*通信作者 E-mail：zhouxm1972@126.com