煙粉虱取食感染TYLCV番茄對其解毒酶和保護酶活性的影響

曹 增, 王金娜, 張友軍, 吳青君, 謝 文, 王少麗

(中國農業科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

煙粉虱取食感染TYLCV番茄對其解毒酶和保護酶活性的影響

曹 增, 王金娜, 張友軍, 吳青君, 謝 文, 王少麗*

(中國農業科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

為了明確感染番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄對煙粉虱生理防御的影響,本文采用生化分析法研究了煙粉虱取食感染TYLCV的番茄植株后解毒酶和保護酶活性的變化。結果表明,B型煙粉虱在帶毒番茄上取食72 h及30 d(長期飼養種群)后,其谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CarE)活性呈現先升高后下降的趨勢,而P450酶活性則持續上升,取食30 d種群是對照種群的1.99倍;三大保護酶系超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)則在取食72 h后,酶活性高于對照,而在感染TYLCV番茄上取食30 d后,保護酶活性則持續高于72 h及對照處理,分別是對照種群的1.45倍、8.42倍和5.03倍,差異顯著;Q型煙粉虱表現趨勢與B型煙粉虱相似。研究結果為進一步明確入侵煙粉虱與雙生病毒之間的互作、揭示煙粉虱的適應性機制等補充了資料。

煙粉虱; 番茄黃化曲葉病毒; 解毒酶; 保護酶

煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]屬半翅目(Hemiptera),粉虱科(Aleyrodidae),是一種世界性的重大農業害蟲,該蟲除了以成蟲和若蟲刺吸植物汁液、分泌蜜露引發煤污病、影響植物光合作用之外,還可傳播雙生病毒,如番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),常年使農作物減產30%～50%,嚴重時甚至絕收[1-2]。近年來研究表明,煙粉虱是由形態上不可區分、生物學特性存在顯著差異的30余種生物型(biotype)或隱種(cryptic species)組成的復合種害蟲[3-4]。在煙粉虱眾多生物型或隱種中,B生物型(隱種MEAM1,本文簡稱B型煙粉虱)和Q生物型(隱種MED,本文簡稱Q型煙粉虱)入侵性最強、危害最大。

大量研究表明,煙粉虱-寄主植物-雙生病毒之間存在著明顯的互作[56]。番茄植株感染雙生病毒-番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)后會間接影響到煙粉虱的取食選擇,不帶毒的Q型煙粉虱更喜歡在感染病毒的番茄植株上取食和產卵,而B型煙粉虱則喜歡在健康植株上取食,然而,煙粉虱攜帶雙生病毒后對帶毒和健康番茄植株不存在取食選擇性,研究發現這與番茄植株感染病毒后其揮發物組分發生變化密切相關[5]。煙粉虱體內的TYLCV會影響其生長發育,攜帶TYLCV的B型煙粉虱較未攜毒的B型煙粉虱在棉花植株上的存活率、產卵量均顯著下降,雌成蟲和雄成蟲的體長明顯變短,表現出TYLCV對B型煙粉虱的不利作用;而攜帶和未攜帶TYLCV的Q型煙粉虱在棉花上的生物學特性則無顯著差異,表現為TYLCV對Q型煙粉虱的生長發育呈中性作用[6];而B型煙粉虱取食感染中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的煙草寄主時,其繁殖力和壽命可比對照分別增長18倍和7倍[7]。隨后發現在帶毒煙草寄主上飼養B型煙粉虱時,其產卵量增多,且成熟卵的比例顯著高于土著煙粉虱[8],說明雙生病毒能夠直接調控煙粉虱的生長發育及生殖行為,并通過寄主植物間接影響煙粉虱的種群適合度及其表現[9]。利用刺吸電位技術(electrical penetration graph,EPG)研究同時也證實了病毒能夠不同程度地調控B型和Q型煙粉虱的取食及傳毒能力,進而影響到病毒的傳播和不同種類煙粉虱之間的競爭[10]。而這種植食性昆蟲、病毒與寄主植物之間的互作關系可能因各研究系統中植食性昆蟲、病毒及寄主植物的種類不同而異[7]。

昆蟲在與寄主植物協同進化過程中,形成和構建了自身的防御系統及機制。寄主植物感染毒后,煙粉虱作為媒介昆蟲在寄主植物上取食并獲得病毒,其最快可在5 min之內獲取病毒[1112]。研究證明,煙粉虱在獲得植物病毒后其生物學特性、傳毒能力等均有不同程度的變化[6,10]。同時,雙生病毒對煙粉虱來說是一種異源物質,煙粉虱攜帶該類病毒后,可能會引起自身的防御反應或者調節反應。解毒酶和保護酶是昆蟲體內兩類重要酶系,在對抗逆境及維持昆蟲正常的生理生化代謝方面具有重要作用,常被用來作為評價昆蟲生理適應性的指標[13]。將B型煙粉虱雌成蟲分別飼養在健康和感染TYLCCNV的煙草上后,轉錄組測序及定量PCR研究表明帶毒植物上的煙粉虱體內解毒酶基因表達趨于下調,說明煙粉虱可能通過降低解毒酶活性來降低能量消耗,從而提高其在帶毒植物上的適合度[14]。不同的是,褐飛虱(Nilaparvata lugens St?l)在取食了感染水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)的水稻后,成蟲壽命和繁殖力沒有顯著變化,但其體內的保護酶和解毒酶系活性均顯著升高,促進了褐飛虱在帶毒水稻上的適應性[15]。煙粉虱攜帶雙生病毒是否會出現類似的或者不同的生理防御反應尚不明確。為了揭示煙粉虱取食感染雙生病毒TYLCV的番茄寄主后可能出現的防御反應,本文擬研究其取食感染TYLCV的番茄后體內解毒酶和保護酶活性的變化,以期為進一步深入理解煙粉虱-病毒之間的互作關系,揭示外來入侵煙粉虱的適應性機制及其綜合治理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試煙粉虱與寄主植物

B型和Q型煙粉虱經生物型鑒定[16]后分別在室內以番茄(Lycopersicon esculentum)(‘中雜12號’)為寄主建立試驗種群,室內連續飼養3代以上。溫室內試蟲飼養條件為：(28±1)℃,相對濕度60%～80%,光周期L∥D=16 h∥8 h。

健康的無蟲苗的獲得：在溫室的無蟲間內播種,隨后將長出真葉的番茄苗移栽到直徑約15 cm的營養缽內,整個播種及飼養過程,未施用任何化學農藥。

帶毒番茄植株的獲得：室內選取含2～3片真葉、無病無蟲、長勢一致的番茄植株,將TYLCV分離物DNA-A侵染的重組土壤農桿菌(由中國農業科學院植物保護研究所周雪平教授實驗室構建并惠贈)注射于植株韌皮部,接種后的植株置于溫室養蟲籠中培養。約30 d后,選擇具有明顯發病癥狀(葉脈增粗、葉片背面出現耳突、部分葉片呈黃化,卷曲狀等)的植株,通過PCR檢測[17]確定其攜帶有TYLCV病毒。

煙粉虱試蟲：讓B型和Q型煙粉虱分別在健康和帶毒番茄寄主植物上取食72 h及30 d(約1代,作為長期帶毒蟲源)后,選取成蟲作為試蟲制備酶液。不同飼養期處理和對照均重復3次。

宏觀審慎視角下的國際資本管控，應從優化改進經濟結構體制的大方向出發，逐步增加國內投資減少對國際資本的依賴性。首先要改變外資機構，調借外商直接投資的產業類型和產業結構。出臺相關扶持政策、鼓勵政策，引導外商將資本投資于基礎產業、支柱型產業以及高新產業，對在西部以及經濟發展水平較為落后區域投資的外商應在政策上給與進一步的優惠。從而刺激外商對西部地區進行投資。其次要擴大國內資本的投資范圍。進一步鼓勵號召民間資本擴大其投資領域和范圍，改善我國內部投資市場環境，鼓勵和引導民間資本的健康發展。

1.2 試劑與主要儀器

還原型L-谷胱甘肽(GSH)和還原輔酶Ⅱ(NADPH)均為Roche公司產品;乙二胺四乙酸(EDTA)為Amresco公司產品,純度＞99%;蛋白定量試劑盒購自北京博邁德科技發展有限公司;保護酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所; α-萘酚及其他試劑購自北京化工廠。

PCR儀為美國伯樂公司的S1000擴增儀;高速冷凍型離心機購自Sigma公司;測定酶活性采用SpectraMax M2/M2e型酶標儀(Molecular Devices,美國)。

1.3 煙粉虱解毒酶活性測定

1.3.1 羧酸酯酶(Car E)活力測定

羧酸酯酶活性測定參照van Asperen的方法[18],略作修改。取同一時期初羽化的煙粉虱成蟲50～60頭置于1.5 mL離心管,加入混有1 g/L Triton X-100的PBS緩沖液500μL低溫研磨勻漿,隨后置于4℃下30 min,所得溶液即為酶源。依次取50μL上述酶源于96孔板孔中,每孔中加200μL 6 g/L的RR固藍鹽和1 mmol/L的α-NA的混合液,30℃下反應15 min,測定其在600 nm處的吸光值。重復3次,取平均值。根據制作的標準曲線和酶源蛋白含量的測定結果,計算Car E的比活力(OD/min/mg pro)。

1.3.2 谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性測定

1.3.3 多功能氧化酶P450活性測定

參照Yu等[20]和Feng等[21]的方法測定P450的對硝基苯甲醚O-脫甲基活力,并略有改動。取80頭初羽化的煙粉虱成蟲,液氮速凍后置于玻璃勻漿器中,加入1 m L PBS緩沖液研磨,再轉移到新的1.5 m L離心管中,13 000 r/min,4℃下離心10 min,然后取700μL上清液,加300μL PBS緩沖液,作為粗酶源;取2μmol/L對硝基苯甲醚(PNA)375μL、9.6 mmol/L NADPH 37.5μL和粗酶源337.5μL共750μL作為反應體系,34℃水浴30 min,將反應液加入酶標板孔,每孔200μL,在波長405 nm處讀數。在多功能氧化酶MFO的作用下,底物對硝基苯甲醚生成對硝基苯酚,以對硝基酚作標準曲線,用對硝基酚的生成量表示酶活力[nmol·(mg pro)-1·(30 min)-1]。

1.4 煙粉虱保護酶活性測定

1.4.1 保護酶酶液的制備

取初羽化的煙粉虱成蟲50～70頭,置于滴有50μL預冷的0.05 mol/L PBS無菌水(p H 7.0、含0.01% Triton X-100)的Parafilm膜上,用0.2 m L PCR管底部迅速將煙粉虱充分研磨勻漿,將勻漿液吸入預冷的1.5 m L離心管中,再取50μL PBS緩沖液清洗Parafilm膜與勻漿用的PCR管底部,并與勻漿液混合作為酶源。此步操作在冰浴上進行。待測酶液保存于4℃冰箱,24 h內使用。

1.4.2 保護酶活性的測定

煙粉虱的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性的測定參照史亮等[22]的方法,并嚴格按照南京建成生物工程公司的試劑盒說明書進行。按照說明書依次加入各試劑后, SOD、CAT和POD活性分別于550、405和470 nm波長處測定其吸光值,對照管中加入PBS緩沖液代替酶液。酶活性測定重復3次,取平均值。3種保護酶活性的計算公式詳見劉建業等[23],保護酶活力單位為U/mg pro。

1.5 酶源蛋白質含量測定

采用Bradford考馬斯亮藍G-250法[24],按照蛋白定量試劑盒說明書進行,以牛血清白蛋白(BSA)含量為自變量,測定的OD值為因變量制作蛋白標準曲線,重復3次;用于解毒酶和保護酶活性測定的待測酶液,與考馬斯亮藍混勻后再靜止放置10 min,測定595 nm處的吸光值,根據蛋白標準曲線計算待測酶液的蛋白含量。

1.6 數據分析

煙粉虱的酶活性均采用平均值±標準誤(standard error,SE)來表示,測定數據采用Excel進行處理,方差分析采用SPSS軟件(SPSS for Windows,Rel.17.0.0 2009.Chicago：SPSS Inc.)進行,并采用Fisher’s LSD法進行差異顯著性分析(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 TYLCV對B型和Q型煙粉虱解毒酶活性的影響

B型煙粉虱在感染TYLCV的番茄寄主上取食72 h后,其羧酸酯酶(Car E)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)和P450酶系的活性較對照均有不同程度的升高,其中羧酸酯酶活力升高最明顯,從(30.22± 2.05)OD/min/mg pro升高到(63.39±6.48)OD/ min/mg pro,差異達極顯著水平(P＜0.000 1), P450活性較對照也升高,差異達顯著水平(P＜0.05),GSTs活性在B型煙粉虱中升高不顯著,而在Q型煙粉虱中升高顯著;而當煙粉虱在帶毒番茄寄主上飼養30 d后,其體內的GSTs和Car E活性均下降,低于在健康植株上飼養的對照種群的活性,但B型煙粉虱的P450酶活性[(26.60±0.64) nmol/mg pro/30 min]則顯著高于對照及在帶毒寄主上飼養72 h的種群,為對照種群的1.99倍(圖1a)。整體上,Q型煙粉虱的解毒酶活性變化趨勢與B型煙粉虱一致(圖1a～b)。

圖1 TYLCV對煙粉虱解毒酶活性的影響Fig.1 Effects of TYLCV on the activities of detoxification enzymes of Bemisia tabaci

2.2 TYLCV對B型和Q型煙粉虱保護酶活性的影響

與飼養在健康番茄上的煙粉虱相比,在感染TYLCV的番茄寄主上取食72 h的煙粉虱種群,其保護酶SOD、CAT、POD活性均有所升高。對于B型煙粉虱來說,在帶毒番茄上飼養72 h,其POD活性[(5.430±0.43)U/mg pro]比取食健康番茄的煙粉虱POD活性[(1.683±0.15)U/mg pro]顯著升高(P＜0.05);CAT活性也顯著升高,但SOD活性與對照差異不顯著;而當B型煙粉虱在帶毒番茄寄主上飼養30 d時,其SOD、CAT和POD活性分別為(52.040±5.07)U/mg pro、(13.559±1. 32)U/mg pro和(8.446±0.62)U/mg pro,為對照種群的1.45倍、8.42倍和5.03倍,差異顯著(圖2a、c和e)。對Q型煙粉虱來說,在帶毒寄主上飼養72 h時,僅CAT活性升高不顯著;而飼養30 d后, CAT和POD活性與對照和帶毒寄主上飼養72 h處理相比均顯著升高,而SOD活性與對照種群,以及感病寄主上飼養72 h的種群無顯著差異,(圖2b、d和f)。

3 結論與討論

昆蟲對其接觸的外源性物質的響應非常靈敏,其解毒酶系的活性可以被外源化合物誘導,使昆蟲在受到外界環境變化的壓力時迅速反應并做出調整,而保護酶的作用則幫助協調昆蟲的自由基控制在一個較低水平,維持昆蟲正常的生理活動[23]。煙粉虱取食感染雙生病毒的寄主植物會獲得病毒,雖然已有研究表明雙生病毒能夠通過降低寄主植物的防御能力來提高煙粉虱的適合度,使之能夠更好地適應和取食,這種互惠關系在雙生病毒與Q型煙粉虱的互作關系中表現得更明顯[25-26]。但可以推測,煙粉虱在帶毒寄主植物上取食及其與病毒互作的過程中,也要調整自身生理并做出防御反應以適應病毒的進入,因此煙粉虱體內生理指標會發生變化。

本研究表明,煙粉虱在帶毒番茄上飼養初期(72 h),煙粉虱獲得病毒后,體內解毒酶活性會有短暫的誘導升高現象(圖1),表現為病毒對煙粉虱解毒酶活性的短期誘導作用;但在帶毒植物上飼養時間延長為30 d后,解毒酶GSTs和Car E活性又開始下降,甚至低于對照處理,這與以前的研究結果是吻合的,當B型煙粉虱在健康和感染中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)的煙草寄主上取食后,在帶毒寄主上取食的煙粉虱的解毒酶基因的表達表現為下調,推斷其可能是通過降低解毒酶活性來減少能量消耗,由此增加其在帶毒寄主植物上的適合度[14]。同時本研究也表明,當煙粉虱在感染雙生病毒的番茄植株上長期飼養時,僅有P450酶活性呈現持續升高現象,這與方勇[27]報道的煙粉虱攜帶TYLCV后,對阿維菌素、噻蟲嗪、吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺、聯苯菊酯等5種藥劑的敏感性均有不同程度的下降的結果也是相符的。而煙蚜[Myzus persicae(Sulzer)]在感染黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的煙草上長期飼養后,其GSTs活性低于健康煙草上煙蚜的GSTs活性,然而CarE活性高于健康煙草上煙蚜[28],和本研究中部分結果存在差異,可能與供試的昆蟲、病毒及植物種類不同有關。

圖2 TYLCV對煙粉虱保護酶活性的影響Fig.2 Effects of TYLCV on the activities of protective enzymes of Bemisia tabaci

不同寄主植物對煙粉虱的生長發育、存活和繁殖等有不同的影響[2930]。昆蟲體內的保護酶系統,在受到植物次生物質誘導或者其他外界刺激時會發生變化,昆蟲體內抗逆性和耐藥性都與它們保持著密切關系。在正常狀況下,細胞內存在自由基清除系統,其中SOD能清除部分自由基而形成H2O2,而POD、CAT具有分解H2O2的作用,三種保護酶系協同作用使得生物細胞內的自由基維持在較低水平,不會引起對機體的傷害[31]。帶毒番茄作為寄主植物飼育煙粉虱后,煙粉虱體內的3種保護酶(SOD、CAT、POD)活性會隨著飼養時間的延長而呈現逐漸升高趨勢。已經證實,昆蟲體內這些保護酶活性的變化與昆蟲的抗逆性和寄主適應性之間有密切關聯[32]。本文研究結果與以往報道一致,白背飛虱[Sogatella furcifera(Horváth)]取食感染水稻黑條矮縮病毒的稻株后,其成蟲體內保護酶(CAT、SOD和POD)活性也顯著增強,生物學參數提高;褐飛虱取食后體內保護酶活性也表現相同趨勢,表明水稻感染黑條矮縮病毒后,白背飛虱和褐飛虱的取食及生長發育的適應性均明顯提高[15,33],結合本研究結果,說明植物病毒對傳毒介體昆蟲和非介體昆蟲體內的防御酶活性均有明顯或顯著影響,昆蟲取食帶毒植物后可誘導其自身保護酶活性的升高。煙粉虱對帶毒寄主植物的適應過程也屬于克服逆境的過程,因此它在適應過程中體內保護酶活性增加,有利于其抵抗體內活性氧的增加,使之更好、更順利地在帶毒植物上生存,所以在帶毒寄主植物上煙粉虱(包括B型和Q型)表現為繁殖力增加、壽命延長等[67]。另外,煙粉虱攜帶雙生病毒TYLCV后,所測試的3大保護酶的變化趨勢不完全一致,這可能與他們具有不同的作用機制有關。本研究中,Q型煙粉虱保護酶活性變化趨勢與B型煙粉虱稍有差異,尤其是SOD活性,Q型煙粉虱在感染TYLCV的番茄植物上繁殖1代后,其SOD活性與飼養72 h時無顯著差異,甚至還略有下降(圖2),推測Q型煙粉虱在攜帶TYLCV病毒后的生理防御變化和對帶毒寄主的適應性比B型煙粉虱更快。

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(責任編輯：楊明麗)

Effects of feeding on TYLCV-infected tomato on detoxification enzyme and protective enzymes of Bemisia tabaci(Gennadius)

Cao Zeng, Wang Jinna, Zhang Youjun, Wu Qingjun, Xie Wen, Wang Shaoli

(Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

In order to explore the physiological response of sweetpotato whitefly,Bemisia tabaci(Gennadius)infected with Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV),the detoxification enzymes and protective enzymes activity of B.tabaci were measured by using biochemical analysis.The results showed that the activities of GSTs and Car E increased after the B.tabaci biotype B were reared on viruliferous tomato plant for 72 h,and decreased when kept on the viruliferous tomato for 30 d.The P450 activity of B.tabaci biotype B was proved to be increasing significantly by 1.99 fold,compared to B.tabaci reared on the healthy plant.The activities of protective enzymes including SOD, CAT and POD in B.tabaci biotype B increased after feeding on viruliferous plant for 72 h,and continued increasing when reared on the TYLCV-infected tomato persistently,reaching 1.45 fold,8.42 fold,and 5.03 fold with signicant difference compared to the control,respectively.B.tabaci biotype Q exhibited similar trend as biotype B.These results provide more information for demonstration of the mutualism between whitefly and begomovirus and the adaptive mechanism of B.tabaci.

Bemisia tabaci; Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV); detoxification enzyme; protective enzyme

S 433

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.018

2014-09-29

2014-11-15

國家自然科學基金項目(31171857);公益性行業(農業)科研專項(201303019);農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室

*通信作者 E-mail：wangshaoli@caas.cn