玉米雌穗揮發物對亞洲玉米螟幼蟲取食選擇的影響

謝興偉, 楊 真, 陳 曉, 蘇國連, 陳 斌, 嚴乃勝, 董文霞

(云南農業大學植物保護學院,農業生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室,云南省農業生物多樣性利用與保護重點實驗室,昆明 650201)

玉米雌穗揮發物對亞洲玉米螟幼蟲取食選擇的影響

謝興偉#, 楊 真#, 陳 曉, 蘇國連, 陳 斌, 嚴乃勝, 董文霞*

(云南農業大學植物保護學院,農業生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室,云南省農業生物多樣性利用與保護重點實驗室,昆明 650201)

為了探明玉米雌穗揮發物組成及其對亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼蟲取食行為的影響,本研究利用頂空吸附法及氣相色譜/質譜聯用技術(GC/MS)測定了離體玉米雌穗的揮發物組分,并通過幼蟲取食選擇試驗測定了11種玉米雌穗揮發物在4個不同濃度下(5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3g/mL,正己烷為溶劑)對亞洲玉米螟取食行為的影響。結果表明：從離體玉米雌穗中共計收集并鑒定出32種揮發物組分,主要包括綠葉氣味物質、萜類化合物和脂肪族化合物。其中,萜類化合物的含量最高,占玉米雌穗揮發物總釋放量的84.40%。在所有測定的濃度范圍內,β-石竹烯、十四烷表現為引誘活性,壬醛表現為驅避作用。除濃度為5×10-3g/m L外,癸烷、反-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮對幼蟲取食表現為引誘作用。

亞洲玉米螟; 玉米雌穗; 植物揮發物; 取食行為

玉米(Zea mays L.)是世界上種植面積最大、分布最廣的作物,也是我國的第三大糧食作物,其種植面積位居我國秋糧之首[12]。亞洲玉米螟[Ostrinia furnacalis(Guenée)]是重要的玉米害蟲,也是我國玉米螟的優勢種。據統計,每年由亞洲玉米螟造成的危害可使玉米減產達30%以上[3]。目前,對亞洲玉米螟的防治仍以化學農藥為主,迫切需要探索新的防治手段。

昆蟲通常依靠自身的化學感受器與周圍環境中的化學信息產生關聯,為其尋找適宜的寄主植物,以完成生存和繁衍[4-7]。通過植物揮發物調控昆蟲的行為是探索害蟲防治的新途徑[8]。國內外關于玉米揮發物與玉米螟行為互作關系的研究已有大量報道[912]。但是有關玉米雌穗揮發物的研究較少,已有的研究主要集中在玉米雌穗苞葉、玉米花絲等的揮發物研究上[13-14],而玉米雌穗揮發物對昆蟲行為的影響也未見報道。

本研究利用頂空吸附法及氣相色譜/質譜聯用技術(GC/MS)測定了玉米雌穗的揮發物成分,并測定了幼蟲對添加了揮發物單組分的人工飼料的取食選擇,旨在篩選對亞洲玉米螟幼蟲取食具有引誘或驅避作用的組分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

玉米‘會單4號’為云南常用的普通品種,在光照培養箱中催芽,并于5 d后選取長勢一致的玉米芽種植于溫室內,行距1 m,株距25 cm,種植后覆蓋地膜。待玉米開花1個月后摘取玉米雌穗進行試驗,無蟲害。

1.1.2 供試蟲源

亞洲玉米螟采自云南農業大學玉米試驗田,在人工氣候箱中連續飼養10代以上,溫度為(26± 1)℃、相對濕度為70%±10%、光周期為L∥D= 14 h∥10 h。幼蟲飼以人工飼料[15];成蟲飼以10%的蜂蜜水。試驗時選取孵化當天的幼蟲。

1.1.3 供試試劑

正己烷(色譜純,98%,Merck)、α-蒎烯(98%, Aldrich)、反-羅勒烯(90%,Aldrich)、β-石竹烯(90%, TCI)、2-己酮(98%,J&K)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(98%,TCI)、壬醛(95%,TCI)、癸醛(95%,TCI)、1-辛烯-3-醇(98%,J&K)、癸烷(99%,Acros Organics)、十四烷(98%,J&K)、十六烷(98.5%,J&K)。

1.2 方法

1.2.1 離體玉米雌穗揮發物的收集

離體玉米雌穗揮發物的收集采用動態頂空吸附法。試驗時選取長勢一致、無病蟲害的玉米植株20株,剪下整個雌穗,放入玻璃干燥器(d=500 mm, h=400 mm)進行揮發物的收集。試驗前通氣10 min去除收集裝置中的氣味。玻璃干燥器上部通入兩根裝有吸附劑(700 mg Porapak Type Q,80-100 mesh,Waters)的巴斯德管,一根用Teflon管連接大氣采樣儀(QC-1S型,北京市勞動保護科學研究所);一根與活性炭相連接,作為凈化空氣的入口。收集時,控制空氣流量為500 m L/min,連續吸附24 h,保持環境通風、無異味,光源為自然光。收集完成后的樣品用2 m L正己烷洗脫至棕色樣品瓶中,加入辛烷和壬酸乙酯各1 000 ng作為內標,用氮吹法濃縮至100μL,于-20℃冷藏待用。重復3次,系統為空白對照。3次試驗所用玉米雌穗質量分別為3 186.35、2 966.16、3 021.17 g。

圖1 氣體收集裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of collection device

1.2.2 揮發物組分的分離與鑒定

利用氣相色譜(GC)/質譜(MS)聯用儀(Agilent 6890A/5973MS,美國Agilent公司)對離體玉米雌穗揮發物進行分析,氫火焰離子檢測器,色譜柱為HP-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);程序升溫：起始溫度40℃,以3℃/min升溫至80℃,再以5℃/min升溫至260℃;柱前壓100 k Pa,載氣為高純氦氣,流速1.0 m L/min,分流進樣,分流比為10∶1,進樣量2.0μL。質譜條件：EI離子源,電子能量70 e V,質子掃描范圍35～500 amu,四級桿溫度150℃,離子源溫度230℃,傳輸線溫度250℃,柱壓100 k Pa。通過核對標準譜庫(Wiley7n.l)與標準化合物的質譜圖,根據標準化合物的保留時間對提取物組分進行定性分析。

1.2.3 玉米雌穗揮發物組分對亞洲玉米螟幼蟲取食選擇試驗

選取已經購買到的11種具有代表性的玉米穗揮發物組分(萜類化合物：α-蒎烯、反-羅勒烯、β-石竹烯;烷烴化合物：癸烷、十四烷、十六烷;酮類化合物：2-己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮;醛類化合物：壬醛、癸醛;醇類化合物：1-辛烯-3-醇),將上述標準化合物配制成5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3g/m L的正己烷溶液,取等量正己烷作對照。取200μL待測樣品溶液均勻涂抹于長方體狀人工飼料(l×w×h=0.8 cm ×0.8 cm×3.0 cm)表面;將處理和對照飼料等距離擺放在普特斯瓶(d×h=6 cm×8 cm)中,接入100頭初孵幼蟲,4 d后統計飼料上幼蟲數量。重復6次。

1.3 數據統計分析

利用峰面積歸一法和內標法對玉米雌穗揮發物各組分進行定量分析,利用χ2檢驗分析幼蟲取食處理與對照間的差異性,利用Duncan氏新復極差法進行顯著性檢驗,相對取食率(%)=處理端幼蟲數/ (處理端幼蟲數+對照端幼蟲數)×100。數據統計分析采用Excel和SPSS 18.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 離體玉米雌穗揮發物的組成及含量

利用頂空吸附法從離體玉米雌穗中共計收集并鑒定出32種揮發物組分,主要包括綠葉氣味物質、萜類化合物和脂肪族化合物(表1)。綠葉氣味物質釋放量較少,占揮發物總釋放量的2.05%,僅有3-己醇和2-己醇。萜類化合物的釋放量最高,占總釋放量的84.40%,包括α-蒎烯、(-)-檸檬烯、反-羅勒烯、反-4.8-二甲基-1.3.7-壬三烯、(+) -環苜蓿烯等18種組分。其中,(+)-環苜蓿烯和α-衣蘭烯的釋放量較高,分別占萜類化合物釋放總量的35.93%和24.17%,反-4.8-二甲基-1.3.7-壬三烯和α-愈創烯的含量較低,分別占萜類化合物釋放總量的0.68%和0.67%。脂肪族化合物包括烴類、酮類、醛類、醇類和酯類共13種,約占揮發物釋放總量的13.56%。其中,2-己酮是釋放量最高的脂肪族化合物,占脂肪族化合物釋放總量的15.20%;十一烷的釋放量最低,占脂肪族化合物釋放總量的3.28%。

表1 玉米雌穗揮發物的組成及含量1)Table 1 Component quantities of corn ear volatiles

續表1 Table 1(Continued)

2.2 玉米雌穗揮發物組分對亞洲玉米螟幼蟲取食行為的影響

亞洲玉米螟幼蟲對經正己烷處理與未經處理的飼料的取食選擇沒有顯著差異(χ2=6.359;P= 0.384),處理端的取食率為51.11%±2.25%,未處理端的取食率為48.89%±2.25%。11種化合物在4種不同濃度下對亞洲玉米螟初孵幼蟲取食選擇的結果表明,β-石竹烯(5×10-6g/m L：χ2=39.587, P=0.000;5×10-5g/m L：χ2=32.914,P= 0.000;5×10-4g/m L：χ2=170.753,P=0.000; 5×10-3g/m L：χ2=17.610,P=0.007)和十四烷(5×10-6g/m L：χ2=18.363,P=0.005;5×10-5g/m L：χ2=20.087,P=0.003;5×10-4g/m L：χ2=44.9736,P=0.000;5×10-3g/m L：χ2= 13.089,P=0.042)對初孵幼蟲的取食行為表現出顯著的引誘作用,壬醛(5×10-6g/mL：χ2=17.464, P=0.008;5×10-5g/m L：χ2=19.330,P=0.004; 5×10-4g/m L：χ2=16.631,P=0.011;5×10-3g/ m L：χ2=20.632,P=0.002)對初孵幼蟲的取食行為表現出顯著的驅避作用。其余8種化合物在濃度為5×10-6g/m L時,6-甲基-5-庚烯-2-酮(χ2= 32.821,P=0.000)、反-羅勒烯(χ2=18.301,P= 0.006)、癸烷(χ2=16.008,P=0.014)、對初孵幼蟲有顯著的引誘作用;6-甲基-5-庚烯-2-酮(χ2=32.740, P=0.000)、2-己酮(χ2=16.249,P=0.012)、α-蒎烯(χ2=29.781,P=0.000)、反-羅勒烯(χ2=85.390, P=0.000)、癸烷(χ2=18.954,P=0.004)在濃度為5×10-5g/m L時具有引誘作用;6-甲基-5-庚烯-2-酮(χ2=67.110,P=0.000)、1-辛烯-3-醇(χ2= 64.808,P=0.000)、十六烷(χ2=38.001,P= 0.000)、反-羅勒烯(χ2=39.258,P=0.000)、癸烷(χ2=40.831,P=0.000)、2-己酮(χ2=15.968, P=0.014)、α-蒎烯(χ2=16.561,P=0.011)在濃度為5×10-4g/m L時對初孵幼蟲取食有顯著的引誘效果;當濃度為5×10-3g/mL時,2-己酮(χ2=57.741, P=0.000)對幼蟲取食具有引誘作用,而6-甲基-5-庚烯-2-酮(χ2=37.989,P=0.000)和癸醛(χ2=14.549, P=0.024)對初孵幼蟲取食有顯著的驅避效果。

3 討論

植物揮發物通常包括綠葉氣味物質、萜類化合物、芳香族化合物和脂肪族化合物[16]。其中,萜類化合物對于植物體的防御系統具有重要意義,一些萜類化合物不僅對植食性昆蟲具有驅避甚至是毒殺作用,還具有引誘天敵的通訊作用[1718]。本研究中,從離體玉米雌穗中收集到的萜類化合物的含量占總釋放量的80%以上,與Huang等[10]的研究結果較為相似。這可能是由于受機械損傷后激活了自身的防御機制而導致一些具有防御意義的次生物質大量釋放;也可能是在長期的進化過程中所形成的一種自我保護的特性[19]。本研究所收集到的32種揮發物組分中,未鑒定出芳香族化合物的存在。

表2 11種揮發物組分對亞洲玉米螟幼蟲取食行為的影響1)Table 2 Effects of 11 volatile compounds on feeding behavior of Asian corn borer larvae

國內外已利用水蒸餾法、固相微萃取法、頂空吸附法等對玉米花絲[2022]、玉米籽粒[21,2324]、玉米苞葉[20]的揮發物組分進行了研究。本研究共鑒定出32種揮發物,其中17種揮發物成分在上述研究中已有報道。此外,本研究中發現了11種萜類化合物,如反-羅勒烯、反-4.8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(+)-環苜蓿烯、α-古蕓烯、β-古蕓烯、α-愈創烯、γ-古蕓烯、α-花柏烯、γ-杜松烯、δ-杜松烯、α-桉葉油醇和4種脂肪族化合壬烷、癸烷、3-己酮、2-甲基辛酸乙酯,這些物質尚未見報道,這些特有組分可能是由于收集的時間、方法及玉米的品種、部位等差異所導致。

當揮發物樣品濃度較高時,6-甲基-5-庚烯-2-酮處理后的飼料對幼蟲表現出顯著的驅避活性,而在低濃度條件下表現引誘效果。這可能是由于供試化合物的濃度過大,遠高于自然狀態下的揮發物濃度,導致幼蟲出現明顯的逃逸反應。因此,揮發物的濃度對昆蟲的行為調控起著重要作用。

當揮發物樣品濃度較高時,6-甲基-5-庚烯-2-酮處理后的飼料對幼蟲表現出顯著的驅避活性,而在低濃度條件下表現引誘效果。Huang等[10]的研究發現,在0.5μg濃度條件下,壬醛對亞洲玉米螟初孵幼蟲定向行為具有顯著的驅避效果,與本研究的結果一致;2-己酮和β-石竹烯對幼蟲幼蟲定向行為沒有影響,而本研究中發現2-己酮(5×10-4、5×10-5、5×10-6g/mL)和β-石竹烯(5×10-3、5×10-4、5×10-5、5×10-6g/mL)對亞洲玉米螟初孵幼蟲取食具有引誘作用,這可能是因為試驗濃度范圍存在差異所導致,也可能是幼蟲定向和取食行為之間不具有明顯的關聯性。

4 結論

本研究從離體玉米果穗揮發物中初步篩選出了對亞洲玉米螟初孵幼蟲的取食行為具有引誘作用的組分—β-石竹烯、十四烷、癸烷、反-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮,以及具有驅避作用的組分—壬醛。

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(責任編輯：田 喆)

Effects of volatiles from corn ear on the larval feeding behavior of the Asian corn borer,Ostrinia furnacalis

Xie Xingwei, Yang Zhen, Chen Xiao, Su Guolian, Chen Bin, Yan Naisheng, Dong Wenxia

(College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Key Laboratory of Agro-Biodiversity and Pest Management of Education Ministry of China,Yunnan Key Laboratory of Agro-Biodiversity and Conservations,Kunming 650201,China)

In order to understand the volatile components of corn ear and their effects on larval feeding behavior of Asian corn borer,Ostrinia furnacalis,the volatile chemicals from corn ear were collected using headspace,and identified by using the gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).The feeding behavior of the first-instar larvae were evaluated by exposing them to 11 selected volatile compounds at four dosages(5×10-6,5×10-5,5× 10-4and 5×10-3g/m L with hexane as solvent).There were 32 compounds identified,including green leaf volatiles(GLV),terpenoids,and aliphatic compounds.The content of terpenoids was the highest,reaching 84.40% of total compounds.β-Caryophyllene and tetradecane showed significant attractant effect on larval feeding behavior at all tested concentrations,but nonanal showed significant repellent effect.Decane,(E)-ocimene and 6-methyl-5-hepten-2-one showed significant attractant effect except at the concentration of 5×10-3g/m L.

Ostrinia furnacalis; corn ear; plant volatile; feeding behavior

S 435.132,Q 968.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.016

2014-09-17

2015-01-20

國家“973”計劃項目(2011CB100404);云南農業大學學生科技創新創業基金項目(2013ZK031)

致 謝： 感謝中國科學院昆明植物研究所余珍老師在植物揮發物鑒定上給予幫助。

*通信作者 E-mail：dongwenxia@163.com

#同等貢獻,為并列第一作者