柴胡配伍解毒化濁藥對乳腺癌引經增效的實驗研究

胡升芳　陳紅風　谷煥鵬等

摘要：目的通過觀察柴胡配伍解毒化濁藥對乳腺癌的作用，探尋柴胡引經增效的機制，為中醫中藥抗乳腺癌肝轉移提供實驗依據。方法體內實驗：引經中藥的藥物血清干預SK-BR-3 人乳腺癌細胞株，觀察中藥對SK-BR-3細胞凋亡及細胞周期的影響。體外實驗：40只BALB/c雌性裸小鼠背部右側皮下接種人乳腺癌MDA-MB-435細胞，7 d后隨機分3組，引經中藥組，中藥組，生理鹽水組，給藥21天后稱取各組裸鼠體重、瘤重、計算腫瘤抑制率，觀察裸鼠肝脾組織病理HE染色。結果引經中藥組阻止SK-BR-3細胞周期的G2/M期，抑制細胞的有絲分裂，減少G0/G1期細胞數量。高劑量引經中藥組誘導細胞凋亡作用明顯，與生理鹽水組比較有顯著性差異，P<0.05。引經中藥組抑瘤率為56.21%，中藥可明顯降低腫瘤和脾重量，與生理鹽水組比均有顯著性差異，P<0.05。3組肝臟重量無明顯變化，生理鹽水組出現肝細胞壞死和炎細胞浸潤。結論柴胡通過阻止SK-BR-3細胞周期抑制增殖和誘導腫瘤細胞凋亡發揮抑制腫瘤生長的作用。柴胡能引解毒化濁藥入肝脾對接種人乳腺癌MDA-MB-435細胞的裸小鼠的肝脾病變起引經增效作用。

關鍵詞：引經藥；柴胡；HER-2陽性；乳腺癌；肝轉移

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2015）06-0083-03

中國癌癥研究基金會調查研究表明，乳腺癌已經成為對女性威脅最大的惡性腫瘤。乳腺癌肝轉移因缺乏明確的靶向性，對化療反應差，是影響乳腺癌預后較重要的因素。HER-2陽性乳腺癌因其生存率低、惡性程度高、易發生肝轉移轉移、預后差[1]，以研究乳腺癌肝轉移的機制及治療方法評估一直是乳腺癌動物模型研究的重點。中醫認為腫瘤藥物靶向與中醫歸經（引經）理論有相似性[2]，總結多年臨床經驗[3-6]，發現引經藥柴胡對抗腫瘤中藥有協同作用，本研究通過觀察引經中藥柴胡與解毒化濁藥物協同對乳腺癌肝轉移的影響，探尋中藥歸經與作用靶點的關系，為合理選擇抑癌中藥提供依據。

1實驗材料

1.1細胞株人乳腺癌細胞株SK-BR-3購自上海中科院細胞所，MDA-MB-435人乳腺癌高轉移細胞，浙江中醫藥大學動物中心提供。實驗動物BALB/C雌性裸小鼠，SPF級，體重20 g±2 g，4-6周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2藥物及試劑中藥組方（解毒化濁藥）：黃芪、白術、茯苓、蚤休、蛇六谷、半枝蓮、石上柏：引經中藥組方：柴胡配伍解毒化濁藥。以上中藥飲片均由浙江中醫藥大學附屬門診部中藥房提供。RPMI 1640 培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone 公司；Annexin V/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒購自美國BD Pharmingen公司。

1.3實驗儀器及設備CO2培養箱（伯樂公司），熒光倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇凈），BECKMAN 流式細胞儀（BECKMAN公司），勻漿機，熒光定量PCR儀，超低溫冰箱，微量核酸測定儀，冷凍高速離心機（BECKMAN公司）。

2實驗方法

2.1中藥含藥血清的制備雌性Wistar大鼠10只，體重（180±20）g，隨機分組5組，每組2只。實驗共分5組：中藥低劑量組、引經中藥低劑量組、中藥高劑量組、引經中藥高劑量組、生理鹽水組。中藥低劑量組2.68 g/kg/d，灌胃，每天1次，每次2 mL；引經中藥低劑量組、2.83 g/kg/d，每次2 mL；中藥高劑量5.36 g/kg/d，灌胃每天1次，每次2 mL；引經中藥高劑量組5.66 g/kg/d，每次2 mL；生理鹽水組給等量生理鹽水，灌胃，每天1次，每次2 mL，連續4天取動物血清。

2.2裸鼠移植瘤模型建立及分組取對數生長期的MDA-MB-435細胞，0.25%胰酶消化后，無菌PBS漂洗細胞2遍，離心，用無血清的DMEM/F12 培養基重懸細胞，調整細胞數為1×107 /mL，每只BALB/c 裸鼠用1 mL注射器接種200 μL細胞懸液于其背部右側皮下。細胞接種7d后，測量腫瘤隨機分組。本實驗共分3組：中藥組、引經中藥組、生理鹽水組。中藥組，每只裸鼠灌胃每天兩次，每次0.3 mL；引經中藥組，灌胃每天兩次，每次0.3 mL；生理鹽水組給等量生理鹽水，灌胃每天早晚兩次，每次0.3 mL。給藥時間均為21 d。

2.3標本取材用藥后第21 d，將小鼠脫頸處死，取腫瘤瘤塊、肝和脾臟，分別稱重。將肝組織分別放入10%中性甲醛固定，做HE染色。

3觀察指標及統計方法

3.1引經中藥對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞凋亡的影響AnnexinV-FITC/PI法細胞凋亡分析，將含藥血清作用24 h及未加藥處理的SK-BR-3 細胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，將待測細胞數調整為1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，離心10 min，棄上清液，PBS洗滌，將細胞重懸于binding buffer300 μL，加入Annexin V-FITC 10 μL，輕輕搖勻，室溫反應，加入PI5 μL輕輕搖勻，室溫反應15 min，細胞經200目尼龍網過濾后，在流式細胞儀上進行檢測。分析細胞凋亡率。

3.2引經中藥對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞周期的影響將含藥血清作用細胞及未加藥處理的SK-BR-3 細胞用胰蛋白酶消化，并用磷酸鹽緩沖液洗滌，將待測細胞數調整為1×106 /mL，取1mL于1000 rpm，離心10 min，棄上清液，95%乙醇固定，上機前用PBS清洗1次，轉速1500轉/min，5 min，棄上清液。加1%曲通（Tritonx-100）1mL，室溫下靜置10 min，離心，棄上清液，加PBS清洗1次，加0.01% RNASE酶1 mL，37度水浴恒溫箱振蕩10 min，離心，棄上清液，加0.05%碘化丙啶1 mL染色，用200目的尼龍網過濾后，存放在4度冰箱內，20 min后用流式細胞儀檢測。

3.3測量裸鼠瘤重、脾重及計算腫瘤抑制率觀察各組小鼠腫瘤出現速度及生長情況，稱取各組小鼠瘤重、脾重及計算腫瘤抑制率：抑瘤率=（對照組瘤重-治療組瘤重）/對照組瘤重。

3.4觀察裸鼠肝組織病理HE染色石蠟切片制作：肝臟組織0.6×0.6cm→10%中性福爾馬林固定（24h）→酒精脫水→二甲苯1h→浸蠟3h→包埋→切片→烘干。HE染色：蘇木素15 min，水洗，1%分化液3秒水洗20 min，伊紅3 min，無水酒精脫水，二甲苯透明，封片。

3.5統計學方法用SPSS10.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用ANOVA分析，P<0.05為差異有顯著性意義的數值.

4結果

4.1引經中藥對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞周期24 h、48 h的影響觀察各組藥物對細胞周期24h的影響發現，引經中藥組主要阻止細胞于G2/M期，抑制細胞的有絲分裂，減少G0/G1期細胞數量。觀察各組藥物對細胞周期48h的影響發現，中藥組及引經中藥組主要阻止細胞于G2/M期，抑制細胞的有絲分裂，減少G0/G1期細胞數量。見表1，表2

5討論

目前乳腺癌嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發病率已居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌術后復發轉移，是導致最終治療失敗的主要原因。臨床上陸德銘教授根據中醫歸經引經理論和辨證論治原則，結合現代腫瘤多靶向治療觀點，治療乳腺癌患者術后肝轉移有獨創的見解。

陸德銘教授認為在十二經絡中女子“乳頭屬肝，乳房屬胃”，即肝胃兩經，肝主疏泄與藏血，情緒過激，肝火過旺，沖脈與任脈就虛弱，乳房得不到應有滋養，氣滯血瘀，久則聚痰釀毒，凝結御乳中成巖。乳絡是乳房的經絡歸屬，即中醫所講的“歸經”。藥有引經專長的思想最早見于《神農本草經》，后張潔古在《醫學啟源》云：“柴胡，少陽、厥陰引經藥也”，《神農本草經》謂柴胡“主心腹腸胃中結氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”。柴胡不但具有疏肝樞轉少陽之功，而且能疏通三焦和胃，治療乳腺癌患者術后肝轉移時，陸教授加入柴胡引經藥物，通過經絡髓道直達病所，可起到腫消，痛止，瘀散，堅化之作用。現代藥理研究認為中醫的歸經理論與現代腫瘤靶向治療觀點極為相似。治療時加入引經藥物，將直接增強治療藥物在靶器官的濃聚，降低不良反應，增加治療效果。

現代醫學研究認為抑制增殖和或誘導腫瘤細胞凋亡是許多藥物抑制腫瘤生長機制之一，細胞周期是指細胞從DNA合成前期開始到有絲分裂完成的整個過程，抗腫瘤藥物對各期細胞的敏感性不同，中藥抗癌也可通過阻滯細胞周期而起作用。從引經中藥對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞周期的影響觀察到，高劑量引經中藥組主要是使細胞阻止于G2/M期，抑制細胞的有絲分裂，減少G0/G1期細胞數量，而且增加作用腫瘤細胞時間，能明顯增強對細胞周期的影響。通過本實驗觀察發現，引經中藥通過對人乳腺癌細胞株SK-BR-3細胞周期改變的影響細胞的增殖。

中藥對誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究結果表明中藥對腫瘤細胞有一定的誘導凋亡作用，高劑量引經中藥組誘導細胞凋亡作用較明顯，用藥組凋亡率隨濃度加大和加入引經中藥柴胡后，有增大凋亡趨勢。本實驗結果表明，引經中藥能增強中藥誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長。

體外實驗觀察引經中藥對裸鼠腫瘤的影響，結果發現，引經中藥組可以明顯降低腫瘤重量，抑瘤率為56.21%。通過肝臟的病理變化發現，生理鹽水組肝細胞壞死，肝索排列紊亂，匯管區有炎細胞浸潤，而中藥組、中藥引經組裸鼠未見肝細胞壞死，肝索排列相對于生理鹽水組整齊，引經中藥不但能增強中藥的抗癌效果，而且能引經入肝，對肝起保護作用。本次實驗觀察時間較長，雖觀察到生理鹽水組出現肝壞死，證實了柴胡的引經增效作用，但未能觀察到生理鹽水組出現肝轉移，尚不能驗證中藥治療乳腺癌肝轉移的確切療效，對于本次實驗中出現的一些尚不明確的結果，可能與實驗動物模型設計上還存在局限性有關，進一步的研究可考慮選用HER-2轉基因小鼠提高誘發乳腺癌肝轉移率，更好觀察中藥治療乳腺癌肝轉移的作用機制。

參考文獻：

[1]Jia WJ，Jia HX，Feng HY，et al.HER2-enriched Tumors Have the Highest Risk of Local Recurrence in Chinese Patients Treated with Breast Conservation Therapy[J].Asian Pac J Cancer Prev.2014，15（1）：315-20.

[2]趙瑞芝，劉少軍.中藥引經理論與靶向給藥[J].中醫雜志，2005，46（9）：643.

[3]胡升芳.陸德銘教授治療HER-2過表達型乳腺癌術后經驗研究[C].陸德銘治療乳房疾病學術思想和臨證經驗研討會論文集.2013，57-60.

[4]胡升芳，陳紅風，陸德銘.HER-2過表達乳腺癌治療研究進展[J].中華中醫藥學刊，2011，29（3）：560-562.

[5]胡升芳.陸德銘教授治療乳腺疾病學術經驗及HER-2過表達型乳腺癌術后診療規律研究[D].上海：上海中醫藥大學，2011.

[6]胡升芳，陳紅風，秦悅農，等.乳寧Ⅱ號方防治乳腺癌術后復發轉移臨床療效評價[J].中華中醫藥學刊，2009，27（11）：2396-2398.

（收稿日期：2015-03-04）