伏立諾他含量測定及其穩定性考察

詹長娟，徐偉，王翼，王華，盧瑋

(南京理工大學泰州科技學院化工學院，泰州 225300)

伏立諾他含量測定及其穩定性考察

詹長娟，徐偉，王翼，王華，盧瑋

(南京理工大學泰州科技學院化工學院，泰州 225300)

目的 建立測定伏立諾他含量及有關物質的高效液相色譜法，考察光照、溫度和濕度對伏立諾他質量的影響。方法 采用Inertsil ODS-SP色譜柱，含量測定以0.1%磷酸溶液(三乙胺調節pH至3.0)-乙腈(70：30)為流動相，有關物質以0.1%磷酸溶液(三乙胺調節pH至3.0)-乙腈(60：40)為流動相；流速1.0 mL·min-1；檢測波長242 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃；樣品超聲時間20 min。依據2010年版《中華人民共和國藥典》二部附錄“原料藥與藥物制劑穩定性實驗指導原則”的有關技術要求進行影響因素實驗。結果 伏立諾他與各雜質之間均達到良好分離，伏立諾他在20.16～302.40 μg·mL-1范圍內線性關系良好(r=0.999 7)。經影響因素實驗后伏立諾他含量及有關物質均無明顯變化。結論 伏立諾他對光照、高溫、高濕穩定。

伏立諾他；含量；有關物質；色譜法，高效液相

伏立諾他是世界上第一個抑制組蛋白去乙酰基酶的新型抗癌藥，于2006年在美國上市，臨床用于其他藥物無效、惡化或病情反復的轉移性皮膚T淋巴細胞瘤[1]。除起始原料苯胺、辛二酸外，伏立諾他中還有可能有一些副產物如辛二酸單酰苯胺、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯[2-4]。筆者建立高效液相色譜法測定伏立諾他的含量及有關物質，并研究溫度、濕度及光照對伏立諾他質量的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LG-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，SPD-20A紫外檢測器，CTO-10AS柱溫箱(日本島津公司)，UV 2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)，AL 104分析天平(梅特勒-托利多，感量：0.1 mg)，WD-A藥物穩定性檢查儀。

1.2 試劑 伏立諾他對照品(含量99.5%，批號：20130326)、伏立諾他樣品(批號：20130415，20130420，20130424)、辛二酸、辛二酸單酰苯胺(批號：20130415)、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯(批號：20130415)均由南京理工大學泰州科技學院制藥工程專業實驗室提供)，乙腈(色譜純)，苯胺、三乙胺、磷酸、氯化鈉、硝酸鉀，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(用三乙胺調節pH至3.0)(含量測定時為30：70，有關物質測定時為40：60)；檢測波長242 nm；流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。

2.2 對照品溶液及供試品溶液的制備 取伏立諾他對照品約50 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入乙腈-水(30：70)超聲20 min溶解，放冷，用乙腈-水(30：70)稀釋至刻度，搖勻，得1 mg·mL-1儲備液。精密量取儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水(30：70)稀釋至刻度，搖勻，即得100 μg·mL-1的對照品溶液。同法制備供試品溶液。

2.3 線性關系考察 分別精密量取對照品儲備液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水(30：70)稀釋至刻度，搖勻，取20 μL進樣，記錄峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，對照品濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程：A=64 519C-250 835，r=0.999 7。結果表明伏立諾他在20.16～302.40 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.4 精密度實驗 精密量取同一份伏立諾他對照品溶液20 μL，連續進樣6次，測定峰面積，RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，分別在0，2，4，8，20，24 h進樣，測定峰面積，RSD值為0.74%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.6 重復性實驗 對同一批樣品平行取樣6份，制備供試品溶液，測定伏立諾他的含量，平均為99.1%，RSD為0.52%，表明重復性良好。

2.7 加樣回收率實驗 分別取3，4，5 mL伏立諾他對照品溶液加入5 mL已知濃度的樣品溶液中，搖勻，測定其含量，計算回收率，分別為103.5%，102.9%，100.2%(n=3)，RSD為1.72%。

2.8 定量限及檢測限測定 取濃度為20.16 μg·mL-1的伏立諾他對照品溶液，用乙腈-水(30：70)逐級稀釋，每次取20 μL進樣測定，檢測限信噪比按3：1計算，定量限按信噪比10：1計算，測得伏立諾他的定量限為33.60 ng·mL-1，檢測限為10.08 ng·mL-1。

2.9 含量測定 取伏立諾他樣品3批，按“2.2”項方法制備供試品溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀。用標準曲線計算其含量，結果3批伏立諾他樣品含量分別為99.2%，99.1%，99.0%。

2.10 有關物質的檢查 取伏立諾他樣品50.0 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈-水(40：60)溶解，超聲20 min，稀釋至刻度，搖勻，作為有關物質檢查的供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用乙腈-水(40：60)稀釋至刻度，搖勻，作為有關物質檢查的對照溶液。取20 μL該對照溶液進樣，調節檢測靈敏度，使主成分峰的峰高為滿量程的20%～25%。分別取按上述方法配制的對照溶液和供試品溶液各20 μL進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的10倍。若供試品溶液色譜圖中有雜質峰，各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積，即要求有關物質的量小于1.0%。3批伏立諾他樣品有關物質測定結果分別為0.50%，0.52%，0.49%(n=2)。

2.11 影響因素實驗

2.11.1 高溫實驗 將伏立諾他供試品置藥物穩定性檢查儀中，在60 ℃條件下放置10 d，在第5天和第10天取樣[5]，檢測其含量以及有關物質。結果見表1。

2.11.2 高濕實驗 將伏立諾他供試品置干燥器中，在25 ℃、相對濕度(90±5)%條件下放置10 d，在第5天和第10天取樣檢測[5]。恒濕條件采用在干燥器中放置硝酸鉀飽和溶液來實現。在實驗開始時稱定質量為0.438 6 g，結束時為0.447 0 g，故吸濕增重<5%，則不需要在25 ℃、相對濕度(75±5)%下同法進行實驗。見表1。

2.11.3 光照實驗 將伏立諾他供試品置藥物穩定性檢查儀中，在照度為(4 500±500) Lx，溫度為25 ℃條件下放置10 d，分別在第5天和第10天取樣檢測[5]。見表1。

3 討論

3.1 檢測波長的考察 取伏立諾他對照品溶液，在紫外分光光度計上于200～400 nm波長范圍內掃描，結果伏立諾他在204和242 nm處有最大吸收峰，由于204 nm是低波長，易受干擾，故選擇242 nm為伏立諾他的檢測波長。將苯胺、辛二酸、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯、辛二酸單酰苯胺分別進行紫外波長掃描，結果辛二酸在210 nm處有最大吸收峰，其余均在242 nm處有最大吸收峰，故選擇242 nm作為有關物質檢測的波長。

表1 影響因素實驗結果 %，n=2

3.2 流動相的考察 參考文獻[6-8]，比較含量測定時流動相中乙腈與0.1%磷酸溶液的比例，分別為40：60，30：70，20：80。當乙腈與0.1%磷酸溶液的比例為30：70時，伏立諾他與其雜質峰能完全分離，拖尾因子最小，理論板數最大。因此含量測定所選用的流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(30：70)。辛二酸的檢測波長為210 nm，在含量測定的條件下，按3倍信噪比計算其最低檢測限為0.543 μg·mL-1，保留時間為5.052 min，與伏立諾他能較好的分離。以乙腈-0.1%磷酸溶液(30：70)為流動相，按外標法測定3批伏立諾他中辛二酸的含量。結果顯示，3批均未檢出辛二酸。故辛二酸不作為有關物質檢查的內容。分別配制苯胺、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯、辛二酸單酰苯胺與伏立諾他對照品溶液及這4種溶液的混合溶液。以不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液(用三乙胺調節pH至3.0)為流動相，將混合溶液進樣，當乙腈-0.1%磷酸溶液的比例為40：60時，各色譜峰能達到較好的分離，故有關物質檢查采用乙腈-0.1%磷酸溶液(40：60)為流動相。

依據2010年版《中國人民共和國藥典》二部附錄ⅩⅨC“藥物穩定性實驗指導原則”對伏立諾他進行了影響因素實驗，結果伏立諾他含量及有關物質均無明顯變化。故伏立諾他在高溫、高濕、光照條件下穩定。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.026

2014-05-19

2014-11-04

詹長娟(1974-)，女，江蘇揚州人，講師，碩士，研究方向：藥物分析。電話：0523-86150675，E-mail：jenny_yz@sina.com。

R979.1；R927.1

B

1004-0781(2015)08-1084-03