羅格列酮對百草枯致大鼠肺損傷的炎癥抑制作用*

劉振寧，高嵩嵐，張紅雷，趙敏

(中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004)

·藥物研究·

羅格列酮對百草枯致大鼠肺損傷的炎癥抑制作用*

劉振寧，高嵩嵐，張紅雷，趙敏

(中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004)

目的 研究羅格列酮對百草枯致大鼠肺損傷過程中的炎癥抑制作用機制。方法 將72只SD雄性大鼠隨機分成3組，每組24只。模型對照組：腹腔注射百草枯20 mg·kg-1；羅格列酮組：腹腔注射百草枯前1 h，腹腔注射羅格列酮10 mg·kg-1；空白對照組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL。注射百草枯后4，8 h及1，3 d，收集各組大鼠血清和肺組織標本，組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色進行肺損傷評分，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，采用免疫組化方法檢測NF-κB蛋白在肺組織的表達，利用Western blot法檢測肺組織核因子-κB (NF-κB)和激活蛋白(AP-1)蛋白表達水平。結果 模型對照組大鼠血清炎性細胞因子IL-1β和TNF-α含量明顯增加。羅格列酮組肺組織損傷程度明顯降低，血清IL-1β和TNF-α含量減少，肺組織NF-κB和AP-1 蛋白的表達降低。結論 羅格列酮可以抑制百草枯中毒大鼠肺組織NF-κB和AP-1 蛋白表達，減少IL-1β和TNF-α分泌，對百草枯所致大鼠肺損傷炎癥有抑制作用。

羅格列酮；百草枯；損傷，肺；核因子-κB；激活蛋白-1；炎癥

百草枯(paraquat，PQ)屬于有機雜環類觸殺型除草藥，是目前我國以及亞太其他地區廣泛使用的除草藥之一。自殺性口服或誤服PQ中毒病例屢見不鮮，由于目前臨床缺乏有效解毒藥，導致該病死亡率較高[1]。PQ通過肺多胺攝取系統并蓄積于肺組織，定位于Ⅰ、Ⅱ型肺泡細胞及細支氣管細胞，產生氧化應激以及炎癥反應，導致急性肺損傷。臨床急性期可以表現為急性呼吸窘迫綜合征，慢性期可以表現為肺纖維化。羅格列酮是過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptors，PPAR-γ) 的激動藥，可以激活PPAR-γ產生抗氧化作用和抗炎作用[2-3]。核因子-κB (nuclear factor - kappa B，NF-κB)[4]和轉錄因子激活蛋白-1(activating protein-1，AP-1)[5]都是炎癥反應的關鍵調控因子，參與許多炎癥性疾病發生、發展過程。筆者在本研究中采用羅格列酮對PQ中毒大鼠進行預處理，檢測NF-κB和AP-1以及炎性細胞因子表達，研究分析羅格列酮對百草枯導致肺損傷的炎癥抑制作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠，體質量200～250 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。生產許可證號：SCXK(遼)2003-0009，使用許可證號： SYXK(遼)2003-0013。大鼠適應性喂養1周，大鼠飼養的溫度控制20～25 ℃、濕度控制40%～70%，晝夜節律控制12 h，自由進食水。

1.2 藥品與試劑 PQ(50 mg，批號：36541 )、羅格列酮(10 mg，批號：R2408 )購自美國Sigma-Aldrich公司，樣品純度均為分析純；白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)Elisa試劑盒(批號：E09479-1641，E09323-1639)購自美國eBioscience公司；NF-κB p65抗體(批號：ab23218)購自美國Abcam公司；c-Fos和c-Jun抗體(批號： sc-52，sc-44)購自美國Santa Cruz公司；SABC免疫組化試劑盒(批號：SA1055)和DAB顯色試劑(批號：AR1022)購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 儀器與設備 石蠟切片機和石蠟包埋機(Leitz，德國)；電泳儀、半干轉印儀(BIO-RAD，美國)；冷凍離心機(Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1，美國)；顯微攝像系統(Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本)。

1.4 動物分組與給藥 將72只SD大鼠隨機平均分成3組，每組24只。模型對照組：腹腔注射PQ20 mg·kg-1；羅格列酮組在腹腔注射PQ前1 h腹腔注射羅格列酮10 mg·kg-1；空白對照組：0.9%氯化鈉溶液1 mL，腹腔注射。

1.5 標本的采集及保存 在PQ腹腔注射后4，8 h及1，3 d時，每組在每個時間點取出6只大鼠，充分麻醉后常規消毒，打開胸腔，使用5 mL注射器刺入右心室，緩慢取血。將血置入10 mL離心管中，3 000 r·min-1(r=9.64 cm)、4 ℃，離心10 min，取上清液置-80 ℃冰箱保存。完整取出兩側肺組織，使用0.9%氯化鈉溶液沖洗肺組織，將肺葉液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 檢測方法與指標

1.6.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色與肺組織損傷評分 將固定好的大鼠肺組織切割組織塊，至厚度約0.5 cm，常規組織梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片，行HE 染色。 光鏡下觀察肺組織病理學變化，并按MIKAWA等[6]方法進行肺損傷評分。評分標準如下：對肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項指標，分別依病變輕重評分為0～4分(0分：無病變或非常輕微；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變)。各項評定分數相加為肺損傷總評分。

1.6.2 血清IL-1β和TNF-α含量測定 將收集的大鼠血清嚴格按照酶聯免疫吸附(enzyme-linked immuno serbent assay,ELISA)試劑盒說明書進行檢測。

1.6.3 NF-κB免疫組織化學染色 將肺組織切片用0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗2次，3% H2O2孵育15 min，PBS洗3次，3% Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)抗原修復15 min，滴加10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉游離的結合位點，室溫20 min，以減少非特異性染色，傾去切片上血清，滴加1：500稀釋的兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜。陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃過夜。PBS洗3次，滴加生物素標記的山羊抗兔二抗工作液(1：200)，室溫孵育20 min，PBS洗3次，滴加SABC，室溫20 min。PBS沖洗5 min×4次。DAB顯色劑顯色3 min左右，自來水充分沖洗終止顯色。蘇木精復染30 s，分色，二甲苯透明，晾干，顯微鏡下觀察。

1.6.4 Western blot 檢測肺組織NF-κB和AP-1的表達 按細胞核蛋白提取試劑盒說明書，提取肺上皮細胞核蛋白，進行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL 加樣；使用10%聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V 條件下PVDF膜轉膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加NF-κB p65一抗(1：50)和c-Fos、c-Jun一抗(1：50)，4 ℃過夜； 用含0.1% Tween 20 的TBS 沖洗5 min × 3次，再加入二抗(1：500) 室溫下孵育2 h，用0.1%TBST 沖洗15 min×3次，ECL發光檢測，X線下顯影，掃描圖像，測得各條帶的灰度值，以β-actin為內參，比較其表達量的變化。

鋼軌波浪型磨耗是指線路在投入運營后，出現在鋼軌接觸表面的類似波浪形的不均勻磨損。鋼軌波浪形磨耗形成之后，列車行駛其上必將激勵起車輛、軌道系統的振動, 而且這種振動是隨著軌道不平順的加劇而加劇的。車輛、軌道系統的劇烈振動不僅引起行李移位，使旅客舒適度降低，而且還會加速動車組車輪和軌道結構的破壞。隨著我國高速鐵路運營里程的增加和車次的增多，鐵路現場鋼軌波磨分布變得更加廣泛，問題日益嚴重。對已經開通的高速鐵路波磨成因等問題進行研究，不僅對整治已有高速鐵路出現的波磨問題起到積極作用，而且對新開通和尚未開通的線路，也能起到很好的預測和防護作用。

2 結果

2.1 HE染色與肺組織損傷評分 空白對照組肺組織肺泡結構完整，無滲出。模型對照組大鼠在3 d 時顯微鏡下可見肺泡結構破壞，肺間質水腫，大量炎性細胞浸潤。羅格列酮組中百草枯中毒的大鼠肺損傷程度明顯減輕，肺損傷評分明顯下降，與模型對照組比較，差異有統計學意義(P< 0.05)。見圖1。

2.2 血清IL-1β和TNF-α含量測定 模型對照組大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量呈時間依賴性增加，而羅格列酮組大鼠血清中二者表達量均明顯下降，尤其在中毒1和3 d時，與模型對照組比較，差異有統計學意義。見圖2。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅格列酮組

2.3 NF-κB蛋白在肺組織中的表達 NF-κB在正常肺組織中支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞存在少量表達。模型對照組NF-κB在肺組織中表達明顯增加，而羅格列酮組表達明顯減少。見圖3。

2.4 Western blot 檢測NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺組織中的表達 Western blot 結果提示NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在正常組中僅有少量表達，而模型對照組中表達則明顯增加，使用羅格列酮預處理以后二者表達明顯下降(P<0.05)。見圖4。

3 討論

與模型對照組比較，*1P<0.05

A.空白對照組；B.模型對照組；C.羅格列酮組

A.電泳圖；B.矩形圖；與模型對照組比較，*1P<0.05

PQ造成的肺損傷除了直接的細胞毒性外，還通過生成活性氧自由基激活炎性細胞，合成并釋放大量的細胞因子參與炎癥反應。NF-κB是由Rel/NF-κB家族的多肽成員組成的一組轉錄因子，被稱為是免疫炎癥反應的中樞調節者[9]。通常所說的NF-κB指的是具有轉錄活性的p50/p65異源二聚體[10]。當細胞暴露于各種病原體時，或者在應激狀態下，NF-κB便可以被激活，啟動和調控多種與炎癥反應有關的細胞因子(IL-1β、TNF-α等)、黏附分子和趨化因子的表達。NF-кB活化同時也導致中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞數量異常增加，進一步釋放大量細胞因子，造成組織損傷。然而細胞因子可以反過來進一步促進NF-кB的活化，從而形成一個正反饋環路[11]。此外，激活蛋白AP-1也參與調控很多炎性因子的表達，進而影響疾病的發展和轉歸[12]。AP-1 是由 c-fos 和 c-jun 蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態下，AP-1 的蛋白濃度和活性極低，分子結構以 c-jun 同源二聚體為主。當細胞受到刺激時，c-jun、c-fos 表達水平增高，并轉變為c-fos、c-jun 異源二聚體并促進細胞因子的轉錄合成。動物實驗研究發現大潮氣量機械通氣可以導致肺組織AP-1 mRNA 及其蛋白表達增加，肺組織病理損傷程度加重，可能是呼吸機相關性肺炎發生的重要因素之一[13]。

TNF-α是導致細胞或組織損傷的主要細胞因子，在局部或全身損傷后幾分鐘內由巨噬細胞釋放，然后作用于組織細胞，使其發生溶解和死亡。IL-1β對巨噬細胞及中性粒細胞的趨化和黏附具有重要作用，增強血管通透性，能夠誘導IL-6合成，下調血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)表達，進一步加重TNF-α導致組織損傷。本實驗研究結果提示PQ中毒以后，大鼠肺泡結構破壞，肺間質水腫，炎性細胞浸潤，同時也發現肺組織中NF-κB和AP-1蛋白表達增加，血清中炎性細胞因子IL-1β和TNF-α表達增加。分析升高的原因可能有兩方面原因：一是PQ中毒后產生的大量氧自由基，導致其NF-κB和AP-1的激活，引起下游炎癥細胞因子基因轉錄和表達；另一方面TNF-α、IL-1β等細胞因子的大量釋放，進一步引起NF-κB和AP-1的活化。

羅格列酮是與PPAR-γ具有高親和力的激動藥，可以激活PPAR-γ在調節糖脂代謝、炎癥控制和免疫調節過程中發揮關鍵作用[14]。PPAR-γ直接與NF-κB、AP-1以及信號轉導和轉錄活化因子-1(signal transducer and activator of transcription-1，STAT-1) 結合形成轉錄抑制性復合物，從而阻止這些轉錄因子的活化[15]。研究發現，PPAR-γ活化可以抑制中性粒細胞浸潤，抑制肺泡上皮細胞產生單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，減少炎癥細胞因子(TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1β)的分泌，抑制巨噬細胞表達iNOS和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，進而抑制單核細胞在肺組織中的趨化聚集發揮抗炎作用[16]。

本實驗研究結果提示羅格列酮可能通過激活PPAR-γ受體，抑制NF-κB和AP-1的活化，進而抑制炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的表達和分泌，抑制炎癥反應，減輕PQ所造成的肺組織損傷。鑒于本課題組前期研究結果[17]以及相關研究報道[18]，本實驗研究采用10 mg·kg-1劑量羅格列酮對PQ中毒大鼠進行預處理，僅對其作用機制進行了初步研究。羅格列酮作為PPAR-γ激動藥，與炎癥抑制作用可能存在著量效關系和時效關系，需要進一步實驗進行研究。

[1] GIL H W，KANG M S，YANG J O，et al.Association bet-ween plasma paraquat level and outcome of paraquat poisoning in 375 paraquat poisoning patients[J].Clin Toxicol(Phila)，2008，46(6)：515-518.

[2] MENG Q Q，LIANG X J，WANG P，et al.Rosiglitazone en-hances the proliferation of neural progenitor cells and inhibits inflammation response after spinal cord injury[J].Neurosci Lett，2011，503(3)：191-195.

[3] WANG W M，CHEN H，ZHONG F，et al.Inhibitory effects of rosiglitazone on lipopolysaccharide-induced inflammation in a murine model and HK-2 cells[J].Am J Nephrol，2011，34(2)：152-162.

[4] 岳峰，李民.核因子κB與高氧性肺損傷發病機制的研究進展[J].中國微創外科雜志，2013，13 (7) ：662-664.

[5] 馬巖，葉冬青.激活蛋白 1 與自身免疫性疾病的研究進展[J].中華疾病控制雜志，2012，16 (5)： 442-445.

[6] MIKAWA K，NISHINA K，TAKAO Y，et al.ONO-1714，a nitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits[J].Anesth Analg，2003，97(6)：1751-1755.

[7] DINIS-OLIVEIRA R J，DUARTE J A，S′ANCHEZ-NAVA-RRO A，et al.Paraquat poisonings： mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment[J].Crit Rev Toxicol，2008，38(1)：13-71.

[8] 趙波，菅向東，張忠臣，等.百草枯染毒大鼠組織中毒物含量與臟器損傷的關系[J].中華勞動衛生職業病雜志，2010，28(3)： 220-223.

[9] 張卓一，吳立群，丁黎敏，等.紅景天苷對百枯草中毒大鼠肺組織、TGF-β1表達的影響[J].中國現代應用藥學，2014，31(11)：1308-1312.

[10] 唐秀能，韋紅棉，黃仁彬.月光花豆乙醇提取物對兔性肺損傷大鼠的保護作用[J].醫藥導報，2014，33(5)： 569-572.

[11] 李徽徽，汪華學，柴繼俠，等.膿毒癥致大鼠急性腎損傷中炎癥介質的變化及機制探討[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2014，23(2)： 159-164.

[12] MEADE A J，MELONI B P，CROSS J，et al.AP-1 inhibitory peptides are neuroprotective following acute glutamate excitotoxicity in primary cortical neuronal cultures[J].J Neurochem，2010，112(1)：258-270.

[13] 曹大偉，張新日，李陽，等.不同潮氣量機械通氣對大鼠肺組織激活蛋白-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的影響[J].中華肺部疾病雜志，2013，6(1)： 36-41.

[14] 黃輝.羅格列酮對糖尿病牙周炎大鼠炎癥反應的影響研究[J].中國全科醫學，2014，17(6)：645-651.

[15] 高夏青，薛凌.羅格列酮對兔心肌缺血再灌注損傷保護機制研究[J].中國現代應用藥學，2014，31(3)：265-270.

[16] HUSSELL T，BELL T J.Alveolar macrophages： plasticity in a tissue-specific context[J].Nat Rev Immunol，2014，14(2)：81-93.

[17] LIU Z N，ZHAO M，ZHENG Q，et al.Inhibitory effects of rosiglitazone on paraquat-induced acute lung injury in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2013，34(10)：1317-1324.

[18] GENOVESE T，CUZZOCREA S，DI PAOLA R，et al.Effect of rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12，14-prostaglandin J2 on bleomycin-induced lung injury[J].Eur Respir J，2005，25(2)：225-234.

DOI 10.3870/yydb.2015.08.002

Inhibitory Effect of Rosiglitazone on Inflammation in Paraquat-induced Lung Injury in Rats

LIU Zhenning, GAO Songlan, ZHANG Honglei, ZHAO Min

(DepartmentofEmergencyMedicine,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To study inhibition effect of rosiglitazone on lung injury induced by paraquat. Methods 72 male SD rats were randomly divided into three groups (n=24)： model control group, paraquat (PQ) was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg·kg-1； rosiglitazone group, rosiglitazone (10 mg·kg-1, ip) was administered 1 h before PQ administration； blank control group, 1 mL 0.9% sodium chloride solution was administered intraperitoneally.The concentration of TNF-α and IL-1β in serum was measured by ELISA at 4, 8 h and 1, 3 day(s) after PQ exposure.The lung injury scores and nuclear factor - kappa B(NF-κB) positive signal were investigated 3 days after PQ exposure by HE staining and immunohistochemistry, respectively.Protein expression levels of NF-κB and activating protein-1(AP-1) were also determined by using Western blotting. Results The levels of IL-1β and TNF-α in serum of PQ-treated rats were significantly increased as compared with blank control group.Rosiglitazone pretreatment reduced the degree of lung tissue injury, the levels of IL-1β and TNF-α in serum, and the protien expression levels of NF-κB and AP-1 as compared with the model control group. Conclusion Rosiglitazone can inhibit NF-κB and AP-1 protein expression in lung tissue, reduce the levels of IL-1β and TNF-α in serum after PQ exposure, and exert an inhibition effect on inflammation in PQ-induced lung injury of rats.

Rosiglitazone；Paraquat；Injury, lung；Nuclear factor-kappa B；Activating protein-1； Inflammation

2014-06-16

2014-10-15

*國家自然科學基金資助項目(81171793)；遼寧省教育廳高等學?？茖W研究一般項目(L2014300)

劉振寧(1981-)，男，遼寧大連人，講師，博士，研究方向： 急性藥物中毒的基礎與臨床研究。電話：024-96615-64113，E-mail： liuzn999@hotmail.com。

趙敏(1961-)，女，遼寧沈陽人，教授，博士，研究方向： 急性藥物中毒和危重病。電話：024-96615-64131，E-mail： zhaom@sj-hospital.org。

R977.15；R563.1

A

1004-0781(2015)08-0993-05