麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠腦垂體泌乳素表達及乳腺組織形態學的影響

朱夢軍，肖暉，王雄，吳金虎

(武漢市第三醫院藥學部，武漢 430060)

麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠腦垂體泌乳素表達及乳腺組織形態學的影響

朱夢軍，肖暉，王雄，吳金虎

(武漢市第三醫院藥學部，武漢 430060)

目的 觀察麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠垂體泌乳素(PRL)表達及乳腺組織形態學的影響。方法 大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺制備高泌乳素血癥模型。60只大鼠分為正常對照組、模型對照組、溴隱亭組及麥芽提取物大、中和小劑量組。除正常對照組外，其他組進行造模。溴隱亭組給予溴隱亭0.389 mg·kg-1·d-1；麥芽提取物小、中和大劑量組分別給予麥芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常對照組和模型對照組給予等容量純化水。大鼠在造模成功后，灌胃給予相應的藥物進行治療給藥，每次2 mL，每日1次，連續30 d。對大鼠腦垂體PRL陽性細胞進行計數，采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠垂體PRL mRNA的表達水平，以及采用免疫組化法觀察乳腺組織形態學的變化。結果 正常對照組，模型對照組，溴隱亭組，麥芽提取物大、中和小劑量組的PRL陽性細胞數量分別為(2.4±0.3)，(21.7±0.8)，(3.8±0.5)，(4.5±0.4)，(6.7±0.5)，(15.8±1.2)個，PRL mRNA表達水平分別為(0.31±0.02)，(1.58±0.06)，(0.45±0.04)，(0.49±0.03)，(0.61±0.04)，(0.95±0.09)。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體PRL陽性細胞數量和PRL mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)，同時乳腺組織出現增生。與模型對照組比較，麥芽提取物大、中劑量組大鼠腦垂體PRL陽性細胞數量和PRL mRNA表達水平顯著減少(P<0.01)，而且乳腺增生明顯減輕。結論 麥芽提取物能有效治療高泌乳素血癥及抑制乳腺組織的增生，作用機制是其顯著降低高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL的表達。

麥芽提取物；高泌乳素血癥；垂體；泌乳素；乳腺組織

高泌乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)是由病理性、藥理性、生理及特發性因素引起泌乳素濃度增高(>25 ng·mL-1)的一種下丘腦-垂體疾病，臨床上以閉經、月經稀少、不孕及溢乳等癥狀常見[1]。在普通人群中HPRL的發生率為0.4%，而在生殖障礙的女性發病率為9%～17%，是嚴重危害女性健康的一種疾病[2]。目前治療HPRL藥物存在價格昂貴、不良反應大等特點，患者依從性很差，很難堅持治療[3-4]。我國《醫學衷中參西錄》《中華本草》等許多古醫籍和現代中藥學權威工具書均記載和認同麥芽的回乳功效[5-6]。據文獻報道，麥芽提取物能顯著降低高泌乳素血癥大鼠血清催乳素(prolactin，PRL)的水平[7-9]，但是其發揮作用的具體機制尚不清楚。本研究在此基礎上，觀察麥芽提取物對高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL表達水平及乳腺組織形態學的影響，進一步揭示其抗高泌乳素血癥的藥效作用及機制，為其深入研究開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級雌性未孕斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠60只，體質量200～250 g，購于華中科技大學實驗動物中心，合格證號：No.42009800000584，動物生產許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。實驗前動物置于室內適應環境1周，室溫18～25 ℃，相對濕度55%～70%，黑暗和光照時間比12 h：12 h。

1.2 藥物及試劑 麥芽購自湖北清大藥業有限公司，產地安徽亳州，經湖北中醫藥大學藥學院陳科力教授鑒定為麥芽正品[禾本科植物大麥(HordeumVulgare.L)的成熟果實經發芽干燥而得]，符合《中華人民共和國藥典》相關項下的規定。甲磺酸溴隱亭：Novartis Pharma Schweiz AG生產，批號：10080。鹽酸甲氧氯普胺注射液(滅吐靈)：河南潤弘制藥股份有限公司，批號1308612。Trizol、RNA 酶抑制劑(上海麗臣生物科技有限公司，批號：0629546)，大鼠泌乳素基因引物和內標引物由北京奧科生物技術有限責任公司設計，M-MLV 逆轉錄酶、PCR-Mix(武漢博士德生物科技有限公司，批號：55248812)，抗大鼠 PRL 抗體、ENVISION 試劑(美國 DAKO 公司，批號：13214679)，PRL酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，批號：201305443)。

1.3 麥芽提取物的制備 干燥麥芽藥材1 kg粉碎后，經10倍量水煎煮，每次1.5 h，共2次，濾液經減壓濃縮得到麥芽提取物408 g，產率為40.8%，于4 ℃冰箱下保存備用。麥芽提取物以大麥芽堿為其質量控制指標，其大麥芽堿含量不低于0.035%。

1.4 HPRL模型制備與分組給藥 在大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺注射液，劑量為50 mg·kg-1，每天9：00和16：00分別注射1次，連續5 d[10]。ELISA試劑盒檢測大鼠血清中PRL的含量，與正常大鼠比較，造模大鼠血清PRL含量顯著升高，證實HPRL模型制備成功。50只造模成功的大鼠按照隨機數字表法隨機分為5組，每組10只，分別為模型對照組，溴隱亭組，麥芽提取物大、中和小劑量組，以10只正常大鼠作對照。動物灌胃藥物劑量參照人服藥的劑量，采用體表面積法進行換算而來。溴隱亭組給予溴隱亭0.389 mg·kg-1·d-1；麥芽提取物小、中和大劑量組分別給予麥芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常對照組和模型對照組給予等容量純化水。除正常對照組外，其他組進行造模。大鼠在造模成功后，灌胃給予相應的藥物進行治療，每次2 mL，每日1次，連續30 d。

1.5 大鼠腦垂體PRL陽性細胞的計數 給藥30 d后，處死大鼠。摘除大鼠腦垂體，進行常規石蠟包埋，應用免疫組化法檢測大鼠腦垂體組織中 PRL 的水平。石蠟切片脫蠟后，加 3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育 5 min，滴加大鼠來源的 PRL抗體(一抗)，室溫60 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗3 次，每次2 min，然后滴加 Envision試劑(含二抗、三抗)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 次，每次2 min，應用 DAB 溶液顯色，純化水沖洗、復染、脫水、封片。顯微鏡(×200 倍)下，對PRL 陽性細胞進行計數。

1.6 大鼠腦垂體組織中PRL mRNA表達水平的分析 用Trizol抽提大鼠腦垂體組織總RNA，加入三氯甲烷0.25 mL，4 ℃，以12 000 r·min-1的轉速離心5 min，加入等體積異丙醇，混勻后靜置，離心棄上清液，用75%乙醇1 mL洗沉淀，離心棄上清液，室溫干燥。將 RNA 樣品及引物于PCR儀中，進行模板 cDNA 的合成(RT反應)，RT 產物于-20 ℃冰箱保存。對目的基因進行擴增后，將PCR擴增產物加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在70 V 恒壓電泳20 min，于UVP 計算機圖像分析系統測定樣本灰度值，以β-actin 作為內參照，計算相對含量。

1.7 大鼠乳腺組織形態學檢查 乳腺組織經蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后，顯微鏡下進行觀察，包括小葉、腺泡增生情況，導管形狀及厚度，以及是否出現分泌物。

2 結果

2.1 大鼠腦垂體PRL陽性細胞數量分析 在200倍視野下，隨機計5個小格的PRL陽性細胞數，取平均值。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體PRL陽性細胞平均計數顯著升高(F=20.146，P<0.01)；與模型對照組比較，溴隱亭組(F=16.227，P<0.01)、麥芽提取物大劑量組(F=14.131，P<0.01)和中劑量組(F=11.552，P<0.01)的PRL陽性細胞平均計數明顯減少。見表1。

表1 6組大鼠腦垂體PRL陽性細胞數量測定值

Tab.1 Positive cell count of pituitary PRL in six groups of rats

±s

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P< 0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P< 0.01

2.2 RT-PCR檢測大鼠腦垂體組織PRL mRNA表達水平 PRL在各組大鼠垂體組織中均有表達，其中模型對照組的表達水平明顯高于正常對照組，溴隱亭組、麥芽提取物大和中劑量組的表達水平明顯低于模型對照組，見圖1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦垂體組織PRL mRNA表達水平顯著升高(F=14.536，P<0.01)；與模型對照組比較，溴隱亭組(F=12.473，P<0.01)，麥芽提取物大劑量組(F=10.662，P<0.01)和中劑量組(F=7.145，P<0.05)的PRL mRNA 表達水平明顯降低，見表2。

2.3 對乳腺組織病理形態學的影響 顯微鏡下可見，正常對照組大鼠乳腺小葉、腺泡和導管無增生、擴張，腺體數量少，無分泌物；模型對照組大鼠乳腺小葉、腺泡和導管嚴重增生，存在大量分泌物；溴隱亭組大鼠乳腺小葉、腺泡部分增生，導管輕度擴張，可見分枝，腔內有少許分泌物；麥芽提取物小劑量組大鼠乳腺小葉、腺泡和導管嚴重增生，仍存在許多分泌物；麥芽提取物大、中劑量組大鼠乳腺腺泡分布均勻，基本恢復正常，大多數導管細長，無分支和分泌物，見圖2。

3 討論

PRL是由位于腺垂體后側位的泌乳細胞所分泌的一種蛋白質類激素，由 199 個氨基酸殘基構成的含3 個二硫鍵的單鏈蛋白，具有一個由4 個反向平行的α螺旋構成的結構[11]。各種因素引起腺垂體嗜酸性細胞分泌過多的PRL(>25 ng·mL-1)，則會引發一系列疾病，西醫稱為HPRL，其臨床表現有溢乳、閉經、月經稀少、不孕等[12]。

M.Marker；A.正常對照組；B.模型對照組；C.溴隱亭組；D.麥芽提取物小劑量組；E.麥芽提取物中劑量組；F.麥芽提取物大劑量組.

圖1 RT-PCR產物

M.Marker；A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.low-dose malt extract group；E：middle-dose malt extract group；F.high-dose malt extract group

Fig.1 RT-PCR products

表2 6組大鼠腦垂體組織PRL mRNA 表達水平

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

血清PRL濃度的增高會擾亂下丘腦-垂體-性腺軸的功能，使下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)合成和分泌受阻，并減弱垂體對GnRH的敏感性，導致促卵泡激素和黃體生成素分泌低下，進而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡發育不良和黃體功能不足而致月經失調、閉經和不孕等。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.溴隱亭組；D.麥芽提取物小劑量組；E.麥芽提取物中劑量組；F.麥芽提取物大劑量組

圖2 6組大鼠乳腺組織形態學病理圖片(HE，×200)

A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.high-dose malt extract group；E.middle-dose malt extract group；F.low-dose malt extract group

Fig.2 Histomorphology of mammery tissue in six groups of rats(HE，×200)

研究發現，PRL與正常乳腺上皮細胞的泌乳素受體結合，會產生一系列反應，包括刺激α乳清蛋白的合成、尿嘧啶核苷酸轉換、乳腺細胞鈉離子(Na+)的轉換及脂肪酸的合成，刺激乳腺腺泡發育和促進乳汁的生成和分泌[13]。泌乳素異常升高可進一步刺激雌激素合成，或抑制孕激素的分泌和抑制促卵泡激素、黃體生成素分泌，從而使雌激素的相對含量及活性增高，導致雌二醇長期過度刺激乳腺組織，從而造成乳腺增生[14]。

文獻報道，麥芽提取物能顯著降低HPRL大鼠血清PRL的水平，但具體作用機制尚不清楚。本研究發現，麥芽提取物能顯著抑制HPRL大鼠腦垂體PRL陽性細胞的數量和PRL mRNA的表達；同時，觀察到HPRL大鼠乳腺組織增生較嚴重，而麥芽提取物能顯著抑制其乳腺組織的增生。該研究從分子水平上證實了麥芽抗HPRL的確切療效，并且揭示其發揮藥效的作用機制是抑制腦垂體PRL mRNA的表達。不過，今后的研究還應深入探索麥芽中抗HPRL的活性成分及作用機制，為開發出具有自主知識產權的抗HPRL藥物奠定基礎。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.012

Effects of Malt Extract on Hypophysis Prolactin Expression and Morphology of Mammary Tissues in Hyperprolactinemia Rats

ZHU Mengjun, XIAO Hui, WANG Xiong, WU Jinhu

(DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effects of malt extract on prolactin expression and morphology of mammary tissue in hyperprolactinemia rats. Methods Metoclopramide hydrochloride was injected subcutaneously to establish hyperprolactinemia model.Sixty rats were divided into normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.Except normal control group, hyperprolactinemia model was established in the other groups.Bromocriptine (0.389 mg·kg-1·d-1) was given to bromocriptine group.Malt extract (7.98, 15.96 and 31.92 g·kg-1·d-1) was administered in low-dose, middle-dose and high-dose malt extract groups.Equal volume of purified water was given to normal control group and model control group.After 30 days of administration, PRL positive cell number of rat hypophysis was counted.RT-PCR was used to measure hypophysis PRL mRNA expression, and morphology of mammary tissues was observed by immunohistochemical method. Results PRL positive cell number was (2.4±0.3), (21.7±0.8), (3.8±0.5), (4.5±0.4), (6.7±0.5) and (15.8±1.2) in normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.PRL mRNA expression level was (0.31±0.02), (1.58±0.06), (0.45±0.04), (0.49±0.03), (0.61±0.04), and (0.95±0.09), respectively.As compared with normal control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group were increased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands appeared.As compared with model control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group was decreased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands was alleviated obviously. Conclusion Malt extract can effectively treat hyperprolactinemia and inhibit hyperplasia of mammary glands through significantly decreasing the expression of hypophysis prolactin in hyperprolactinemia rats.

Malt extract； Hyperprolactinemia； Hypophysis； Prolactin； Mammary tissue

2014-04-17

2014-07-21

朱夢軍(1965-)，男，湖北武漢人，藥師，學士，研究方向：醫院藥學。電話：(0)15971479069，E-mail：zhumengjun133494@163.com。

吳金虎(1962-)，男，湖北十堰人，主任藥師，博士，研究方向：中藥物質基礎研究。電話：027-68894991，E-mail：546939322@qq.com。

R285.5

A

1004-0781(2015)08-1036-04