細(xì)菌生物膜檢測方法改進(jìn)與應(yīng)用

尤理想，趙 青，周 敏，汪意濤，吳淑燕，李嫄淵，黃 瑞

（蘇州大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇蘇州 215000）

細(xì)菌生物膜檢測方法改進(jìn)與應(yīng)用

尤理想，趙 青，周 敏，汪意濤，吳淑燕，李嫄淵，黃 瑞

（蘇州大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇蘇州 215000）

針對結(jié)晶紫染色法為細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）檢測的經(jīng)典方法存在的不足，通過增加乙酸用量和減少洗菌次數(shù)等進(jìn)行改進(jìn)后，BF測定更為準(zhǔn)確。另嘗試采用多模式小動物活體成像系統(tǒng)檢測發(fā)光菌的BF形成，并利用培養(yǎng)板和小圓玻片探究BF在不同載體上的形成情況，以優(yōu)化小動物活體成像系統(tǒng)檢測方法。用改進(jìn)后的2種方法摸索鼠傷寒沙門菌BF形成的最適濃度和時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種濃度為107CFU／mL、培養(yǎng)72h時(shí)檢測效果最佳。在BF檢測方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上。探究鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對BF形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒可促進(jìn)BF的形成。不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1／4MIC（MIC為最小抑菌濃度）雙黃連對BF形成的抑制作用顯著低于1／2MIC和1／8MIC，表明雙黃連的抑菌作用與濃度不成正比關(guān)系，需嚴(yán)格控制臨床用藥劑量。

細(xì)菌生物膜；結(jié)晶紫染色；多模式小動物活體成像系統(tǒng)；鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒；雙黃連

沙門菌（salmonella）主要經(jīng)水和食物傳播，可引起食物中毒、胃腸炎、傷寒和副傷寒等腸道疾病。鼠傷寒沙門菌（salmonella typhimurium）是最早被發(fā)現(xiàn)能引起大規(guī)模食物中毒的沙門菌之一，每年造成上億人發(fā)病［1－2］。細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面而形成的一種與浮游細(xì)菌相對應(yīng)的生長方式［3］，是由細(xì)菌及其產(chǎn)生的胞外多糖形成的特殊細(xì)菌群落。與浮游細(xì)菌相比，處于BF狀態(tài)下的細(xì)菌對不利條件如干燥、極端溫度、抗菌藥物以及消毒劑的抵抗力均明顯增強(qiáng)［4］，目前認(rèn)為99%的細(xì)菌以BF形式存在，65%～80%的人類感染性疾病與BF有關(guān)［5］，成為臨床上難治性感染的重要原因之一［6］。鼠傷寒沙門菌作為臨床上常見的致病菌之一，其致病性和耐藥性與BF密切相關(guān)。由此可見，BF的研究對臨床疾病的診療具有十分重要的意義。結(jié)晶紫染色法是檢測BF的常用方法之一［7］，但在應(yīng)用過程中常出現(xiàn)生物膜脫落、丟失、不能完好保存等弊端，因此本研究對結(jié)晶紫染色方法進(jìn)行了優(yōu)化。此外，首次利用小動物活體成像系統(tǒng)對發(fā)光菌的生物膜檢測進(jìn)行了初步探索。在BF檢測方法和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，探究了鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒與BF形成的關(guān)系，并檢測不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的影響。

1 儀器

超凈工作臺（蘇州蘇凈集團(tuán)），生物安全柜（美國Baker公司），Allegra X－15R低溫高速離心機(jī)（美國Beckman－Coulter公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），多模式小動物活體成像系統(tǒng)DXS4000pro（美國柯達(dá)公司），96孔板和24孔板（美國Corning公司），酶標(biāo)儀MR450（美國Bio－Rad公司），721分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。

2 材料

（1）培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)。

（2）試劑：無水乙醇、33%乙酸溶液、2%結(jié)晶紫溶液（上海國藥集團(tuán)），99%甲醇溶液（上海凌峰化學(xué)試劑公司），注射用雙黃連粉針劑（哈藥集團(tuán)）。

（3）受試菌：攜帶毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌野生株χ3306和質(zhì)粒消除株χ3337由美國亞利桑那州立大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院Roy Curtiss III教授惠贈；含有細(xì)菌熒光素酶操縱子lux的質(zhì)粒pBEN276由法國自然資源研究所動物傳染病和公共健康病原菌研究實(shí)驗(yàn)室Pierre Germon教授惠贈。本文使用的菌株為實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含pBEN276的發(fā)光菌χ3306lux和χ3337lux。

3 方法

3．1 細(xì)菌培養(yǎng)和定量

將保存于－80℃的受試菌接種至LB肉湯，37℃培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)移至血平板活化，分區(qū)劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜，分離純化單菌落后做生化和血清學(xué)鑒定。用接種環(huán)挑取單菌落3～5個，接種于LB肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)16～18h。2 500r／min離心10min，棄上清；生理鹽水（normal saline，NS）洗2次，棄上清；肉湯重懸。細(xì)菌定量方法參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，分光光度計(jì)測受試菌液的吸光度OD600值，每次稀釋采用10－1級（即取0．5mL菌液加入4．5mL無菌NS）連續(xù)稀釋，調(diào)整菌液濃度，同時(shí)選取合適稀釋度做平板菌落計(jì)數(shù)。

3．2 檢測方法的改進(jìn)

3．2．1 結(jié)晶紫染色法改進(jìn)

結(jié)晶紫染色法參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行改進(jìn)。具體過程如下：將χ3306lux按200μL／孔加入96孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)24h或72h；將板內(nèi)菌液吸棄，250μL NS洗2遍（原方法為3遍），每次洗菌后吸棄NS；加入200μL、99%甲醇固定15min，吸棄甲醇，室溫干燥；加入200 μL 2%結(jié)晶紫溶液染色5min，吸棄結(jié)晶紫染液，NS洗2遍，室溫干燥；加入220μL（原方法為200μL）33%乙酸溶解，混勻；酶標(biāo)儀檢測OD570值。每個樣本做3個復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．2．2 小動物活體成像系統(tǒng)方法

將χ3306lux按1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h；將2板內(nèi)菌液吸棄，1．2mL NS洗2遍，每次洗菌后吸棄NS，將24孔板放入成像暗箱平臺，控制平臺升降至一個合適的視野，自動關(guān)閉照明燈，在沒有外界光源的條件下（暗場）拍攝由發(fā)光菌發(fā)出的特異光子，記錄每孔光強(qiáng)度值。另一組在24孔板內(nèi)加入小圓玻片后再加入菌液培養(yǎng)，其余方法同上。每個樣本做3個復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．3 BF形成適宜條件的測定

將χ3306lux按200μL／孔加入96孔板，或按1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為108、107、106、105、104CFU／mL，30℃培養(yǎng)24h或72h，用改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法和小動物活體成像系統(tǒng)測定BF。每個樣本做3個復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．4 鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對BF形成的影響

將χ3306lux和χ3337lux分別按200μL／孔加入96孔板，或1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h。用改良后的結(jié)晶紫染色法和小動物活體成像系統(tǒng)檢測BF的形成。每個樣本做3個復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．5 不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的影響

3．5．1 鼠傷寒沙門菌最小抑菌濃度（MIC）的測定

取無菌試管12支，第1管加入MH肉湯1．6 mL，其余每管加入1mL，在第1管加入雙黃連原液（1 280g／L）0．4mL，混勻后吸取1mL至第2管，混勻后再吸取1mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸棄1mL；然后每管加入χ3306lux1mL，使菌液終濃度為5×105CFU／mL，此時(shí)第1管至第12管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0g／L；35℃培養(yǎng)20h后，以肉眼觀察無細(xì)菌生長的藥物濃度即為最小抑菌濃度MIC。選取1／2MIC、1／4MIC和1／8MIC作為不同亞抑菌濃度，用于以下實(shí)驗(yàn)。

3．5．2 不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的影響

將χ3306lux按100μL／孔加入96孔板，將雙黃連按100μL／孔加入已有菌液的孔中，使菌液終濃度為107CFU／mL，雙黃連的終濃度分別調(diào)整為每孔1／2MIC、1／4MIC和1／8MIC，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h，通過結(jié)晶紫染色法與小動物活體成像系統(tǒng)檢測各孔BF。每個樣本做3個復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

4 結(jié)果

4．1 改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法測定結(jié)果

通過增加乙酸用量至220μL與減少洗菌次數(shù)至2次的優(yōu)化后，用結(jié)晶紫染色法檢測BF。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后測得的BF量較優(yōu)化前明顯增加，見表1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明改良后的結(jié)晶紫染色法對BF量用吸光度OD570表征測定更為準(zhǔn)確。

表1 結(jié)晶紫染色法檢測24h與72hBF形成情況

4．2 小動物活體成像系統(tǒng)檢測法改進(jìn)后測定結(jié)果

經(jīng)肉眼觀察，加小圓玻片組BF雖然浮起，仍完整性較好。經(jīng)小動物活體成像系統(tǒng)測得加小圓玻片組的光強(qiáng)度顯著高于不加小圓玻片組，見圖1和圖2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明小動物活體成像系統(tǒng)可用于發(fā)光菌BF的檢測，加小圓玻片改良后檢測效果更佳。

4．2 BF形成條件的優(yōu)化

4．2．1 結(jié)晶紫染色法檢測BF形成的最適濃度和時(shí)間

酶標(biāo)儀檢測不同時(shí)間和濃度下BF形成的OD570值見表2，結(jié)果顯示培養(yǎng)24h和72h2個時(shí)間點(diǎn)，OD570值均在菌液濃度為107CFU／mL時(shí)最高（p＜0．05）；72h時(shí)各濃度菌液測得的OD570值均高于24h的相應(yīng)濃度（p＜0．05）。由此可見，接種細(xì)菌濃度為107CFU／mL、培養(yǎng)72h最有利于96孔板BF的形成。

圖1 小動物活體成像系統(tǒng)檢測加與不加小圓玻片BF形成情況

圖2 小動物活體成像系統(tǒng)檢測加與不加小圓玻片BF形成情況直方圖

表2 結(jié)晶紫染色檢測不同時(shí)間及細(xì)菌濃度下BF形成的OD570

4．2．2 小動物活體成像系統(tǒng)檢測24孔板BF形成的最適濃度

不同濃度下各24孔板光強(qiáng)度如表3和圖3所示。結(jié)果表明，接種細(xì)菌濃度107CFU／mL時(shí)，24孔板內(nèi)BF的平均光強(qiáng)度較其他接種濃度均高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），故接種細(xì)菌濃度107CFU／mL為24孔板BF形成的最適濃度。

表3 小動物活體成像系統(tǒng)檢測24孔板BF形成的最適濃度

圖3 小動物活體成像系統(tǒng)檢測24孔板BF形成的最適濃度

4．2．3 小動物成像系統(tǒng)檢測24孔板BF形成的最適時(shí)間

按細(xì)菌接種最適濃度107CFU／mL鋪板，于30℃培養(yǎng)24、48、72h后，小動物活體成像系統(tǒng)檢測不同時(shí)間點(diǎn)各24孔板平均光強(qiáng)度見表4。結(jié)果表明BF形成量在72h時(shí)最高，且與其余2個時(shí)間點(diǎn)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。因此24孔板BF形成的最適時(shí)間為培養(yǎng)72h。

表4 小動物活體成像系統(tǒng)檢測24孔板在不同時(shí)間BF的形成情況

4．3 鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒對BF形成的影響

通過結(jié)晶紫染色法檢測鼠傷寒沙門菌χ3306lux和χ3337lux在96孔板上形成的BF，結(jié)果見表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)χ3306lux的OD570值顯著高于χ3337lux，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。經(jīng)小動物成像系統(tǒng)檢測24孔板BF結(jié)果（見圖4）顯示，χ3306lux組的光強(qiáng)度顯著高于χ3337lux組，與結(jié)晶紫染色法結(jié)果一致，即含毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌形成BF的能力比無質(zhì)粒菌強(qiáng)。

表5 結(jié)晶紫染色法測沙門菌質(zhì)粒對BF形成的影響

4．4 不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的影響

圖4 小動物成像系統(tǒng)測沙門菌質(zhì)粒對BF形成的影響

通過MIC測定實(shí)驗(yàn)，得出雙黃連對χ3306lux的MIC為32g／L。用結(jié)晶紫染色法研究不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的作用的結(jié)果見表6。結(jié)果表明，加入雙黃連組的BF形成量顯著低于不加藥組，1／4MIC組的OD570值明顯高于1／2MIC和1／8MIC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明1／4MIC雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的抑制作用最小。小動物成像系統(tǒng)檢測24孔板BF形成結(jié)果（見圖5）顯示，1／4MIC組測得平均相對光強(qiáng)度最高，為22．403±1．374，1／2MIC組和1／8MIC組測得平均相對光強(qiáng)度分別為19．386±0．965和20．420±1．132，與結(jié)晶紫染色法一致，可見1／4MIC雙黃連濃度下BF形成量較其他組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。

表6 結(jié)晶紫染色法測亞抑菌濃度雙黃連對BF形成的影響

5 討論

結(jié)晶紫染色法是一種簡單、方便、準(zhǔn)確性相對較高、且應(yīng)用廣泛的方法。此方法的優(yōu)化對有關(guān)BF的研究具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗菌次數(shù)從3次改為2次后，BF損失降低；增加乙酸量至220μL可保證原氣液面位置的BF完全溶解，改良后有助于更好地保留BF，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

小動物活體成像系統(tǒng)主要由CCD相機(jī)、成像暗箱、激光器、激發(fā)和發(fā)射濾光片、恒溫臺、氣體麻醉系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集的計(jì)算機(jī)及數(shù)據(jù)處理軟件等組成。生物發(fā)光成像是表達(dá)熒光素酶的活細(xì)胞與外源的熒光素反應(yīng)，在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目成正比，具有特異性高、背景噪聲低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)使用的菌株帶有的質(zhì)粒pBEN276含熒光素酶基因操縱子luxCDABE，該基因是一種新型的報(bào)告基因，表達(dá)后產(chǎn)生熒光素酶及其底物，可發(fā)生特異作用而使其標(biāo)記的細(xì)菌持續(xù)發(fā)光。以該基因作為報(bào)告源的生物發(fā)光特異性極強(qiáng)，不需外加底物，具有極低的背景和極高的信噪比，將其插入細(xì)菌染色體中穩(wěn)定表達(dá)，可根據(jù)測得光信號水平直接得出發(fā)光細(xì)菌的相對數(shù)量，故導(dǎo)入質(zhì)粒pBEN276的鼠傷寒沙門菌χ3306lux和χ3337lux可采用小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。BF是由細(xì)菌及其產(chǎn)生的胞外多糖所形成的一種特殊細(xì)菌群落，可根據(jù)測得光信號水平直接觀測BF形成情況，本實(shí)驗(yàn)首次探索了利用小動物成像系統(tǒng)檢測發(fā)光菌BF的形成情況，結(jié)果證實(shí)該方法切實(shí)可行，可對BF形成情況進(jìn)行直接的定性和定量分析，具有簡便、直觀的優(yōu)點(diǎn)，為BF相關(guān)研究方法提供了借鑒。另外，通過該法檢測在不同介質(zhì)上BF的形成情況，證明小圓玻片的加入可有效防止BF被沖洗脫落，并可保存BF完整性。

本研究通過優(yōu)化的結(jié)晶紫染色法和小動物活體成像檢測法，測得BF在24孔板和96孔板形成的最適接種細(xì)菌濃度為107CFU／mL、最適培養(yǎng)時(shí)間為72h。結(jié)果表明，若接種濃度過高或培養(yǎng)時(shí)間過長，細(xì)菌可能由于營養(yǎng)缺乏不利于BF形成；而接種濃度過低或培養(yǎng)時(shí)間過短，則可能由于無法達(dá)到BF形成的最佳菌量而影響B(tài)F形成。

BF與質(zhì)粒的影響是相互的［10］，一方面，BF可保護(hù)細(xì)菌中質(zhì)粒并影響其基因的表達(dá)，BF內(nèi)細(xì)菌對不利條件如干燥、極端溫度、抗菌藥物和消毒劑等抵抗力均明顯增強(qiáng)，且BF內(nèi)細(xì)菌代謝狀態(tài)不同，使細(xì)菌在任何狀態(tài)下都能存活一部分，能夠有效保存質(zhì)粒，BF中存在調(diào)控機(jī)制，能促進(jìn)質(zhì)粒基因的表達(dá)；另一方面，質(zhì)粒基因的表達(dá)也可影響B(tài)F的形成，包括促進(jìn)和抑制兩種作用。本文利用改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法與小動物成像系統(tǒng)，探究了鼠傷寒沙門菌毒力質(zhì)粒對BF形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌形成BF的能力較強(qiáng)，推測鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒可促進(jìn)BF的形成。

BF與臨床感染相關(guān)疾病密切相關(guān)，BF形態(tài)下細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性等與普通浮游生長細(xì)菌顯著不同，且細(xì)菌在BF保護(hù)屏蔽下可逃避抗菌藥物殺傷作用和免疫細(xì)胞吞噬作用［11］。體外實(shí)驗(yàn)中，亞抑菌濃度抗菌藥物對BF形成的調(diào)控作用可隨抗菌藥物種類、濃度、作用時(shí)間和菌種的不同而改變；同種抗菌藥物對同一種屬BF形成的影響，可因條件或菌株的差異呈現(xiàn)抑制或誘導(dǎo)等不同結(jié)果，且條件的改變會顯著影響B(tài)F的形成［12］，故亞抑菌濃度抗菌藥物的使用需十分謹(jǐn)慎。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)優(yōu)化改良的結(jié)晶紫染色法與小動物成像系統(tǒng)探究不同亞抑菌濃度雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的影響，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)1／4MIC雙黃連比1／2MIC和1／8MIC雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的抑制作用小，故可推測雙黃連對鼠傷寒沙門菌BF形成的抑制作用并非隨濃度增大而增強(qiáng)，提示雙黃連的抑菌作用與濃度不成正比，因此在臨床應(yīng)用過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制雙黃連的藥物濃度。

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·字義辨析·

象 與 像

象指自然界、人或物的形態(tài)、樣子，如：印象、表象、形象、現(xiàn)象、景象、函數(shù)圖象等。

像指用模仿、比較等方法制成的人或物的形象，包括由光線形成的與原物相同或相似的圖景，如：人像、攝像、畫像、肖像、影像、圖像、透鏡成像等。

《實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理》編輯部 編錄

Improved method of bacterial biofilm detection and its application

You Lixiang，Zhao Qing，Zhou Min，Wang Yitao，Wu Shuyan，Li Yuanyuan，Huang Rui
（Department of Microbiology，Soochow University，Suzhou 215000，China）

Crystal violet staining is a classical method for the detection of bacterial biofilm（BF），but remains deficiencies in mechanical process．In this study，the method is improved by increasing the amount of acetic acid and reducing washing times．The multi－mode small animal imaging system is used to detect the formation of luminous bacteria，using small circular glass and plastic plates to explore the formation of BF on different carriers to optimize the detection methods．By exploring the optimal concentration and culture time of Salmonella BF formation using the inmentioned improved detection methods，it is found that BF detected effect is the best when inoculating 107CFU／ml of bacteria and cultured for 72h．On the basis of the BF detection method optimization，this article explores the effects of Salmonella plasmid on biofilm formation，and the results show that the plasmid has a role in promoting BF formation．The experimental results of different sub－MIC of Shuanghuanglian on Salmonella BF formation show that 1／4MIC of Shuanghuanglian has the minimum inhibition effect to Salmonella BF formation compared with 1／2MIC and 1／8MIC of Shuanghuanglian，which hints at that the inhibition effect of Shuanghuanglian is not in direct proportion to its concentration and the dosage of clinical medicine needs to be strictly controlled．

bacterial biofilm；crystal violet staining；multi－mode small animal imaging system；salmonella typhimurium plasmid；shuanghuanglian

Q939．93

B

1002－4956（2015）3－0072－05

2014－07－29 修改日期：2014－09－11

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No．2011286）；江蘇省高等學(xué)校創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（No．2012yb017）

尤理想（1991—），男，江蘇連云港，臨床醫(yī)學(xué)七年制學(xué)生

吳淑燕（1972—），女，山東濰坊，博士，副教授，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)

通信作者：李嫄淵（1980—），女，江蘇蘇州，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)．

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