高活性降解羽毛角蛋白菌株鑒定及發酵條件優化

王東方，王慶忠

（濰坊學院山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061）

高活性降解羽毛角蛋白菌株鑒定及發酵條件優化

王東方，王慶忠

（濰坊學院山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061）

通過對已篩選到的產生角蛋白酶的H菌株形態觀察、生理生化試驗分析最終確定該菌為枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis），對該菌的發酵條件進行優化，同時將顯著影響條件進行正交試驗。試驗結果表明，最佳發酵培養基：玉米粉10g，豆粕10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7 g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養基pH 7．5～8．0；最適培養條件：接種量為2%，培養溫度37℃，180r／min搖床培養96h，其產角蛋白酶活性最高為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL）。

角蛋白酶鑒定；枯草芽孢桿菌；發酵條件

隨著我國畜牧養殖業的迅速發展，蛋白質飼料嚴重短缺。羽毛蛋白被認為是一種有獨特價值的優質蛋白質飼料，禽類羽毛中角蛋白的粗蛋白含量高達85%～89%，并且含有多種必需氨基酸［1－2］，因此若將廢棄的羽毛加以適當的加工處理使其轉化為良好的蛋白質資源，對經濟發展和環境保護都具有重要意義［3－4］。

角蛋白（keratin）是一種不溶性蛋白質，肽鏈之間形成許多二硫鍵，不能被動物直接利用。目前，我國處理羽毛等角蛋白廢棄物的方法主要有化學處理法、高溫高壓水解法等，這些方法轉化率低、耗能高、環境污染嚴重［5－6］。利用產生角蛋白酶的微生物將羽毛廢棄物分解為可利用的氨基酸等物質，具有消化率高、對環境污染小的優點。近幾年發表的降解羽毛的微生物有細菌［7－8］、放線菌［9－10］、真菌［11－12］等，但在羽毛角蛋白分解菌的培養和篩選的研究領域僅處在初級階段，還沒有能夠有效提高羽毛角蛋白的生物學利用率的菌株，也沒有加工工藝簡單且成本低的產品工藝。

本研究利用已得到的分解羽毛高產菌株H菌，進行菌種鑒定并通過其培養基成分和培養條件的優化，使得H菌的產酶能力有很大提升，進而為使其應用于飼料等領域提供條件。

1 材料與儀器

1．1 材料

樣品來源：菌種H菌株由微生物實驗室篩選得到；羽毛采集于羽毛加工廠廢棄的完整羽毛。

羽毛培養基：NaCl 0．5g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養基pH7．5～7．8。

種子培養基為LB培養基：蛋白胨10g，酵母提取5g，氯化鈉10g，水1 000mL，培養基pH7．0～7．2。

1．2 試驗儀器

智能生化培養箱（PHX－270N，寧波海曙來福儀器廠）；雙層恒溫搖床（THZ－052D，上海博彩生物科技有限公司）；雙人雙面凈化工作臺（CSW－CJ－2F型，蘇州凈化設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LD2X－50FB，上海申安醫療器械廠）；臺式大容量高速冷凍離心機（Centrifuge 5810R，eppendorf）；紫外可見分光光度計（UV－2480，日本島津公司）；顯微鏡（BX53日本Olympus公司）。

2 方法

2．1 菌株的鑒定

形態觀察：在LB平板上37℃培養24h后觀察菌落形態、色澤、邊緣、表面凹凸度、透明度等；進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡觀察菌體形態和芽孢形狀。生理生化性質的測定參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》［13］。

2．2 角蛋白酶活性測定

角蛋白測定參考Gradisar等［14］的方法并稍做修改。在試管中加入10mg羽毛粉作為反應底物，取1．0 mL粗酶液，再加入2．0mL、0．05mol／L的Tris·HCl（pH7．5），50℃反應30min后取出并加入2．0mL、10%的TCA以終止反應，過濾離心10min，取上清液于280 nm處測定吸光度。酶活性單位定義：在上述反應條件下，測得的D280nm值每升高0．01所需要的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

2．3 發酵條件的優化

（1）發酵時間對菌株產酶的影響：分別在搖瓶發酵24、48、72、96、120h時測定酶活性。

（2）發酵溫度對菌株產酶的影響：分別設置搖瓶發酵溫度為34、37、40、43、46℃，測定發酵酶活性。

（3）不同碳源對菌株產酶的影響：選擇葡萄糖、蔗糖、麩皮、可溶性淀粉和玉米粉作為碳源，在羽毛培養基中分別添加1%的上述幾種碳源后搖瓶發酵，測定發酵酶活性；確定最佳碳源后，再在羽毛培養基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的最佳碳源。

（4）輔助氮源對菌株產酶的影響：選擇NaNO3、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆粕作為輔助氮源，在羽毛培養基中分別添加1%的上述幾種氮源后搖瓶發酵，測定發酵酶活性，再進行最佳氮源的單因子分析（參照③最佳碳源實驗）。

（5）初始pH對菌株產酶的影響：不同初始pH（6．0，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0）的羽毛培養基中培養，測定發酵酶活性。

3 結果與分析

3．1 菌株鑒定

3．1．1 形態特征

菌株H經平板劃線培養出的菌落形態特征如圖1所示：菌落形狀不規則、乳白色、質地潤澤、邊緣缺刻狀、不透明，經革蘭氏染色法鏡檢菌體呈桿狀，常以鏈狀排列，具圓端，為革蘭氏陽性，能產芽孢，芽孢形狀呈橢圓形。

圖1 H菌形態

3．1．2 生理生化特征

菌株的生理生化鑒定結果見表1。芽孢桿菌屬的菌體呈直桿狀，常成對或鏈狀排列，具圓端或方端，大多數細胞在幼齡培養時染色呈現革蘭氏陽性；菌體以周生鞭毛運動，芽孢具橢圓、卵圓、柱狀、圓形的多種形態，可以抗多種不良環境；每個菌體能產一個芽孢且不被氧氣所抑制，為好氧或兼性厭氧異養菌，具有多種發酵或呼吸代謝類型。通過形態特征及生理生化試驗結果，可以確定菌株H為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株H的生理生化試驗結果

表1 （續）

3．2 發酵條件的優化

3．2．1 發酵時間對菌株產酶的影響

菌體生長需要一定的時間，當菌生長到達穩定期時，微生物經過一段時間的生長，由于營養物質已不多，只能維持菌體基本新陳代謝和合成次級代謝產物的需要，一些重要的次級代謝產物是在穩定期開始大量生成的。所以，發酵時間是影響菌株產酶的重要因素。分別在搖瓶發酵24、48、72、96、120h時，測定的酶活性結果見圖2。可以看出，在發酵96h后，菌株的產酶活性濃度最高為1．76×10－3kat／L（105．5U／mL）。

圖2 不同發酵時間下H菌的發酵酶活性濃度

3．2．2 發酵溫度對菌株產酶的影響

微生物的生長及代謝產物的合成都需要酶的參與，適宜的溫度可以促進微生物的生長，不適宜的溫度使菌體生命活力降低，甚至會造成微生物的死亡。此外，在不同的培養溫度下，微生物的代謝產物也不盡相同，并且微生物生長繁殖和產酶的最適溫度也不一樣。分別設定搖瓶發酵溫度為34、37、40、43、46℃，測得的發酵酶活性濃度見圖3。由圖3可知，H菌的最適發酵溫度為37℃，此時酶活性濃度為1．84×10－3kat／L（110．6U／mL）。

圖3 不同發酵溫度下H菌的發酵酶活性濃度

3．2．3 不同碳源對菌株產酶的影響

在微生物發酵過程中，碳源不僅是細胞分子的組成部分，也是合成多糖、蛋白的能量來源。不同細胞對碳源的利用差異很大，碳源的代謝速率影響到微生物的生長和初級及次級代謝產物的形成［15］。在碳源的選擇方面要注意到微生物營養的需求和是否存在對合成代謝的誘導及阻遏作用，故選擇合適的碳源將提高菌株的產酶能力。在羽毛培養基中分別添加1%葡萄糖、蔗糖、麩皮、可溶性淀粉和玉米粉作為輔助碳源后，分別測得的酶活見表2。結果表明輔助碳源中的最佳碳源為玉米粉。這可能是玉米粉除碳水化合物外，還富含蛋白質，在提供了碳源的同時，還提供了氮源，進而提高了菌株發酵產酶的能力。另外，從工業生產降低成本的角度看，玉米粉也是比較理想的碳源。在培養基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的玉米粉后測定的酶活變化趨勢見圖4。由圖4得出，在培養基中添加1．0%的玉米粉時H菌的發酵酶活性最大，酶活性濃度為2．09×10－3kat／L（125．6 U／mL），低于或高于1%時酶活性濃度均有所下降。

表2 添加不同輔助碳源時H菌的發酵酶活性濃度

圖4 添加不同含量玉米粉后H菌的發酵酶活性濃度

3．2．4 輔助氮源對菌株產酶的影響

氮源主要用于菌體細胞物質如氨基酸、蛋白質、核酸等和含氮代謝物的合成。H菌所產的角蛋白酶本質是蛋白質，故而外加氮源可以影響酶的合成。通常能被細菌利用的氮源有銨鹽、硝酸鹽及尿素等，但在吸收速度與利用程度上有所差別［16］。本試驗利用在羽毛培養基中分別添加1%的NaNO3、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、蛋白胨、酵母膏、豆粕作為輔助氮源后，分別測得的酶活性濃度見表3。結果表明輔助氮源中的最佳氮源為豆粕。在培養基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的豆粕后測定的酶活變化趨勢見圖5。由圖5得出，在培養基中添加1%的豆粕時 H 菌的發酵酶活性最大，酶活性濃度為2．138×10－3kat／L（128．3U／mL）。

表3 添加不同輔助氮源時H菌的發酵酶活

圖5 添加不同含量的豆粕后H菌的發酵酶活性濃度

3．2．5 培養基初始pH對菌株產酶的影響

培養基初始pH不僅會引起細胞膜電荷的變化，同時也會改變培養基中化合物的解離程度，影響營養物質的吸收，即使是同一微生物，由于pH不同，所得到的產物也不相同［17］。將菌株置于不同初始pH（6．0，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0）的羽毛培養基中搖瓶發酵后，測得的酶活變化趨勢見圖6。由圖6可知，H菌在培養基初始pH為7．5時產酶能力最強，酶活性濃度為1．81×10－3kat／L（108．4U／mL）。

3．2．6 正交試驗優化產酶條件

圖6 不同初始pH下H菌的發酵酶活性濃度

根據上述單因子實驗結果設計正交試驗以確定菌株發酵的最佳條件，結果見表4，培養基中不同水平的玉米粉、豆粕對菌株產酶能力影響顯著。正交試驗結果，表明在培養溫度為37℃、添加玉米粉為1%、豆粕1%、初始pH為7．5～8．0時發酵產酶能力最強，酶活性濃度為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL）。

表4 正交試驗結果

4 結論

得到的一株可降解羽毛角蛋白的菌株H具有高效降解羽毛角蛋白活性。根據菌種H的表型及生理生化反應方面的結果，可以確定該降解羽毛角蛋白菌株為枯草芽孢桿菌；通過對其發酵條件研究，綜合各單因素試驗及正交試驗，分析得到其最佳發酵條件：最佳發酵培養基為玉米粉10g、豆粕10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養基pH 7．5～8．0；最適培養條件：接種量為2%，培養溫度37℃，180r／min搖床培養96h，在該優化條件下該菌的產酶能力最強，最高酶活性濃度為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL），比初始酶活提高了45．7%。此外，得到的最佳碳源、氮源不僅能使其酶活得到大幅提高，而且來源廣泛、價格低，為角蛋白酶投入大規模工業生產奠定了基礎。

在今后的研究中，可以進行角蛋白的提取分離、純化等方面的研究，并且可以應用基因工程等技術將產酶基因克隆并接合到生長較快速的菌體中，進一步提高角蛋白酶的表達量和活性并拓寬其應用范圍，以更好地應用于工業生產中。

（References）

［1］Cedrola S M L，de Melo A C N，Mazotto A M，et al．Keratinases and sulfide from bacillus subtilis SLC to recycle feather waste［J］．World Journal of Microbiology ＆Biotechnology，2012，28（3）：1259－1269．

［2］McGovern V．Recycling poultry feathers：more bang for the cluck［J］．Environmental Health Perspectives，2000，108（8）：366－369．

［3］Brandelli A．Bacterialkeratinases：useful enzymes for bioprocessing agroindustrial Wastes and Beyond［J］．Food and Bioprocess Technology，2008，1（2）：105－116．

［4］Gupta R，Ramnani P．Microbial keratinases and their prospective applications：an overview［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（1）：21－33．

［5］汪國和，張日俊，丁麗敏．家禽羽毛廢棄物高值化利用研究進展［J］．飼料工業，2005，26（1）：46－48．

［6］何偉．羽毛膨化加工技術［J］．畜產品加工，2002，29（6）：54－56．

［7］Gessesse A，Hatti Kaul R，Gashe B A．et al．Novel alkaline proteases from alkaliPhilic bacteria grown on chicken feather［J］．Enz－ymeand Mierobial Teehnology，2003，32（5）：519－524．

［8］Pathange P，Senigala K，Jayalakshmi K S．Purification and characterization of extreme alkaline，thermostable keratinase，and keratin disulfide reductase produced by Bacillus halodurans PPKS－2［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2010，87（2）：625－633．

［9］Tawfik M M，Rawa B H．Degradation of keratin substrates by fungi isolated from sewage sludge［J］．MycoPathologia，2001（154）：185－189．

［10］Anbu P，Gopinath S C，Hilda A，et al．Purifieation of keratinase from poultry farm isolate－scopulariopsis breicaulis and statistical optimization of enzyme activity［J］．Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5／6）：639－647．

［11］SzabóI，Benedek，SzabóI M，et al．Feather degradation with a thermotolerant streptomyces graminofaciens strain［J］．World Journal of Microbiology＆Biotechology，2000，16（3）：253－255．

［12］Gushterova A，Vaileva－Tonkova E，Dimova E，et al．Keratinase Produetion by newly isolated Antaretic catinomycete strains［J］．World Journal of Microbiology ＆Biotechology，2005，21（6）：831－834．

［13］希坎南R E．伯杰氏細菌鑒定手冊［M］．北京：科學出版社，1989．［14］Gradiar H，Kern S，Friedrich J．Keratinase of doratomyces microsporus［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2000，53（2）：196－200．

［15］Stanbury P，Whitaker A，Hall S．Principles of fermentation technology［M］．Second edition．New Delhi，India：Aditya books Private Limited，1997：93－105．

［16］張誠，鄒景忠．尖刺擬菱形藻吸收動力學以及氮磷限制下的增殖特征［J］．海洋與湖沼，1997，28（6）：599－603．

［17］Klein J，Rosenberg M，Markos J，et al．Biotransformation of glucose to gluconic acid by Aspergillus niger study of mass transfer in an airlift bioreactor［J］．Biochemical Engineering Journal，2002， 10（3）：197－205．

Identification and optimization of fermentation conditionsfor astrain of highly active degradation of feather keratin

Wang Dongfang，Wang Qingzhong
（Key Laboratory of Biochemistry ＆Molecular Biology in Universities of Shandong Province，Weifang University，Weifang 261061，China）

The strain H is identified as bacillus subtilis，based on morphology，physiological and biochemical characteristics．And the fermentation conditions of the strain are optimized，while significantly affecting the conditions which are optimized by orthogonal test．The results show that the optimal fermentation medium will be corn powder 5g，soybean meal 10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，10g feather powder，water 1 000mL，pH 7．5－8．0，and the optimal culture conditions are as follows：inoculation the amount of 2%，temperature 37℃，180r／min shaking culture 96h，the production of keratinase activity up to 2．56×10－3kat／L 153．7（U／mL）．

identification of feather keratin；keratinasebacillus subtilis；fermentation conditions

S816．48

B

1002－4956（2015）3－0063－05

2014－08－31 修改日期：2014－09－24

山東省星火計劃項目（2012XH06031）；濰坊市科技發展計劃資助項目（2011022、20111023）；濰坊學院科技發展計劃項目（2012z07）

王東方（1970—），男，山東濰坊，碩士，講師，研究方向為微生物生理生化及發酵．

E－mail：wangdf＠wfu．edu．cn