二氧化碳浸漬法在藍莓酒釀造中的應用

吳皓玥，董瑩璨，劉雪平，戰吉宬*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

藍莓（blueberry），又稱越橘，屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）落葉灌木型植物，果實呈扁圓形，成熟后呈深藍色[1]，其主要分布在北半球（寒）溫帶地區。藍莓主要有矮叢（V.angustifolium）、高叢（V.corymbosum）、兔眼（V.ashei）和半高叢（V.angustifolium×V.wrymbosum）四大類，其下又分為許多不同品種[2]。藍莓中除了含糖、酸和維生素C（vitaminV，VC）外，還富含VE、VA、VB、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、蛋白質、花青苷、酚酸以及豐富的K、Fe、Zn、Ca等礦質元素[2-3]，MATTILA P等[4]發現藍莓果皮每100 g含85 mg酚酸。其具有很高的醫學和保健價值[5]，聯合國糧農組織將其列為五大健康食品之一[6]。藍莓酒還具有良好的風味，蓋禹含等[7]采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HP-SPME）技術和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術分析以3種不同酵母發酵的藍莓酒的主要香氣，鑒定出76種香氣成分。這些對人體有益的功能性成分及貢獻風味的物質使藍莓研究備受青睞，國際市場前景廣闊。從產業長遠發展看，應該增加藍莓初加工以及深加工產品種類，延長產業鏈條，提升產品附加值。另外，藍莓不耐貯藏，隨著藍莓種植在我國的迅速發展，藍莓加工勢在必行。如何釀造出優質的藍莓酒便成為一個果酒釀造的熱點研究方向。

二氧化碳浸漬（carbonic maceration，CM）法是將整粒漿果置于充滿CO2的密閉容器中，漿果細胞內進行發酵和浸漬作用，包括酒精、揮發物質的形成，蘋果酸的轉化，蛋白質、果膠質的水解以及液泡物質的擴散、多酚類物質的溶解等，浸漬結束后破碎進行酒精后發酵的釀造[8-9]。由該方法釀造的果酒具有一種不同于傳統發酵酒的獨特風味。二氧化碳浸漬法釀造的果酒總酸，尤其是蘋果酸大幅減少，且單寧含量也有所降低[8]，故果酒的口味更加柔和、清新。除在成分、風味上有以上特點外，該工藝生產周期短，企業資金周轉快，能夠成為企業提高經濟效益的有效途徑[10]。但另一方面其最佳飲用期一般不超過3個月，否則二氧化碳浸漬特征會逐漸消失，顏色衰退，色調轉變為橘黃色等，因此適于喜歡新鮮型藍莓酒的消費群體[11-12]。

CO2浸漬法在葡萄酒領域應用廣泛，無論是紅葡萄酒、桃紅葡萄酒，還是原料酸度較高的白葡萄酒釀造均適用[9]。尤其是在法國博若萊地區以佳美葡萄釀造的博若萊新酒最為出名[13]。但是目前該釀造工藝在其他果酒中的應用甚少，因此利用CO2浸漬法釀造藍莓酒的研究前景極為廣闊。本研究利用二氧化碳浸漬法釀造藍莓酒，對比二氧化碳浸漬法和傳統釀酒法釀造出的藍莓酒在各理化指標方面的不同，擬探究該方法對藍莓酒品質的影響；同時利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定CO2不同浸漬時間對于釀藍莓酒中10種有機酸酸、9種酚酸含量的影響。以期為研發二氧化碳浸漬法藍莓酒產品提供理論和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍豐藍莓：青島佳沃藍莓基地；亞硫酸（分析純）：北京化工廠；釀酒酵母DV10：加拿大Lallemand公司；果膠酶（1000000U/mL）：意大利Enartis公司；白砂糖：內蒙古正北食品有限公司；干冰（食品級）：北京天竺佳禾干冰銷售中心。

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、濃鹽酸、氯化鈣、醋酸鈉、冰醋酸、氯化鋁、碳酸鈉、磷酸二氫銨、磷酸、沒食子酸、兒茶素均為分析純：北京化學試劑有限公司；福林肖卡試劑（分析純）、甲醇、乙酸均為色譜純：北京易秀博谷試劑公司；MILI-Q水；草酸、奎尼酸、酒石酸、異檸檬酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、沒食子酸、原兒茶酸、β-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、β-香豆酸、阿魏酸、芥子酸：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外分光光度計：日本島津公司；2695XE分離單元高效液相色譜系統（配有2996PDA紫外檢測器和Empower Software色譜數據處理系統）：美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒試驗方案

表1 藍莓酒釀造方案Table1 The fermentation plan of blueberry wines

1.3.2 分析指標

（1）基本指標測定

根據國標GB/15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，利用比重瓶法測定酒精度、滴定法測定總糖含量、酸堿滴定法測定總酸含量（以檸檬酸計）。

（2）有機酸含量的測定

參照并改進文獻[14]的方法，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定藍莓酒中草酸、奎尼酸、異檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸10種有機酸的含量。

樣品前處理：藍莓酒樣品經高速離心（12 000 r/min、15 min、4 ℃）后，取上清液，用0.45 μm膜過濾，待反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chro matography，RP-HPLC）檢測。

色譜條件：TechMate ST-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相：磷酸二氫銨 40 mmol/L，用磷酸調pH值至2.5；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：210 nm。

（3）總酚含量測定

利用福林-酚（Folin-Ciocalteus）[15-16]法測定藍莓酒中總酚含量，酒樣需經雙蒸水稀釋5倍前處理。以沒食子酸為標準品制作標準曲線，得到標準曲線回歸方程為A=0.120c+0.005，相關系數R2=0.999 0。樣品中總酚含量以沒食子酸表示，單位為mg/L。

（4）總花色苷含量測定

采用pH值示差法[17-18]測定藍莓酒中總花色苷的含量，結果以花青素-3-葡萄糖苷表示，單位為mg/L。

（5）總黃酮含量測定

采用硝酸鋁顯色法[19]測藍莓酒中的總黃酮含量，酒樣需經雙蒸水稀釋5倍前處理。以兒茶素為標準品制作標準曲線，得到標準曲線回歸方程為A=0.021c+0.036，相關系數R2=0.9987。樣品中總黃酮含量以兒茶素表示，單位為mg/L。

采用HPLC法[20]測定藍莓酒中沒食子酸、原兒茶酸、β-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、β-香豆酸、阿魏酸、芥子酸9種酚酸的含量。

樣品前處理：藍莓酒樣品經高速離心（12 000 r/min、15 min、4 ℃）后，取上清液，用0.45 μm膜過濾，待RP-HPLC檢測。

色譜條件：LiChrosspher 100RP-18e色譜柱（250 mm×4 mm×5 μm）；保護柱RP-18（10 mm×4 mm）；流動相A甲醇∶乙酸∶水=10∶2∶88；流動相B甲醇∶乙酸∶水=90∶2∶8；梯度洗脫程序：0～25 min B：0～15%；25～45 min B：15%～50%；45～53 min B：50%～0；流速1 mL/min；柱溫30℃；進樣量15 μL；檢測器：紫外檢測器；紫外檢測波長280 nm。

2 結果與分析

2.1 酸類物質分析

2.1.1 總酸含量

利用酸堿滴定法測定藍莓酒總酸含量，結果見圖1。

圖1 傳統法和二氧化碳浸漬法釀造藍莓酒中總酸含量(x±s，n=3)Fig.1 Total acid content of blueberry wine fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由圖1可知，傳統法釀造的藍莓酒總酸含量高于二氧化碳浸漬法（P＜0.05）。對比不同浸漬時間，發現其對總酸含量無顯著影響（P＞0.05），這可能因為二氧化碳浸漬主要對于從果皮中浸漬得到的物質含量影響較大，而有機酸大部分存在于果肉中。就總酸含量而言，二氧化碳浸漬法能夠明顯降低藍莓酒的酸度，可以緩和藍莓果實酸度較高的味感，使口感更加平衡。

2.1.2 有機酸含量

有機酸標準品高效液相色譜圖見圖2，樣品中各有機酸含量分析結果見表2。

要加強社會整體的信用體系建設，包括個人征信體系和企業信用評價體系等，還要加快互聯網金融平臺與中國人民銀行信用體系建設的對接。除此之外，應當加快第三方信用評級機制的建設，構建第三方動態監管體系。

圖2 10種有機酸標準品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 10 kinds of organic acid standards

由圖2可知，10種有機酸標準品色譜峰分離清晰，基線平穩，可用此方法測定藍莓酒中有機酸含量。

由表2可知，利用高效液相色譜測定藍莓酒中10種有機酸含量，藍莓酒中檸檬酸含量最高，遠高于其他幾種有機酸。其次是琥珀酸、奎寧酸和乳酸，含量在100 mg/L左右，其他幾種酸含量較少，酒石酸未檢出。另外發現二氧化碳浸漬法有機酸含量整體低于傳統法，除乳酸外，其他有機酸含量均為傳統法較高，與總酸的規律一致。探究不同浸漬時間對于藍莓酒有機酸含量的影響，發現除蘋果酸外的大多數有機酸隨浸漬時間延長含量增加。對于和大多數有機酸規律不一致的蘋果酸和乳酸，浸漬時間越長的酒樣蘋果酸越少，乳酸含量越高，原因有待進一步探究。因此，結合總酸含量說明二氧化碳浸漬法能夠降低藍莓酒的酸度。

表2 傳統法和二氧化碳浸漬法釀造藍莓酒中10種有機酸含量(x±s，n=3)Table 2 Contents of 10 kinds of organic acids in blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3) mg/L

2.2 酚類物質分析

2.2.1 總酚含量

利用福林-酚（Folin-Ciocalteus）法測定藍莓酒中總酚含量，結果見圖3。

圖3 傳統法和浸漬法釀造藍莓酒中總酚含量(x±s，n=3)Fig.3 Total phenol content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由圖3可知，對比傳統法和浸漬法總酚含量，發現傳統法明顯高于二氧化碳浸漬法（P＜0.05）。二氧化碳浸漬10 d的酒總酚含量低于浸漬15 d的酒，但浸漬15 d和20 d的酒差異并沒有顯著性。可能原因為浸漬前期，CO2進入果皮細胞中使細胞破碎，且果實無氧呼吸產生的酒精能夠加速果皮中的酚類物質浸出，因此前期浸漬時間越長，總酚含量越高。說明二氧化碳浸漬法能夠降低藍莓酒中酚類物質的浸出，使口感更加柔和，易于廣大消費者飲用。綜合釀造時間及生產成本考慮，浸漬時間以15 d為宜。

2.2.2 總黃酮含量

采用硝酸鋁顯色法測藍莓酒中的總黃酮含量，結果見圖4。

圖4 傳統法和浸漬法釀造藍莓酒中總黃酮含量(x±s,n=3)Fig.4 Total flavonoid content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由圖4可知，浸漬10 d的酒與傳統法所釀藍莓酒總黃酮含量無顯著性差異，但浸漬15d和20d的酒總黃酮含量顯著高于傳統法，初步說明二氧化碳浸漬加強總黃酮的浸出，并且很可能是浸漬10～15 d期間起到關鍵性作用。二氧化碳浸漬法不僅使藍莓酒口感更加柔順，同時能夠加強黃酮類功能性成分的浸出，綜合考慮，二氧化碳浸漬15 d最為適宜。

2.2.3 總花色苷含量

采用pH值示差法測定藍莓酒中總花色苷的含量，結果見圖5。

圖5 傳統法和浸漬法釀造藍莓酒中總花色苷含量(x±s,n=3)Fig.5 Total anthocyanin content of blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3)

由圖5可知，傳統法花色苷含量明顯高于浸漬法（P＜0.05）。探究不同浸漬時間對花色苷含量的影響發現：二氧化碳浸漬15 d的藍莓酒總花色苷顯著高于浸漬10 d和20 d的藍莓酒，這與浸漬時間對于總酚含量影響不一致。二氧化碳浸漬法所釀藍莓酒顏色較淺，但浸漬15 d最利于花色苷的浸出。

2.2.4 酚酸含量

酚酸標準品高效液相色譜圖見圖6，樣品中各酚酸含量分析結果見表3。

圖6 9種酚酸標準品HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of 9 kinds of phenolic acids standards

由圖6可知，9種酚酸標準品色譜峰分離清晰，基線平穩，可用此方法測定藍莓酒酚酸含量。

表3 傳統法和二氧化碳浸漬法釀造藍莓酒中9種酚酸含量(x±s,n=3)Table 3 Contents of 9 kinds of phenolic acids in blueberry wines fermented by traditional and CO2maceration method(x±s,n=3) mg/L

由表3可知，利用高效液相色譜測定沒食子酸、原兒茶酸、β-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸9種酚酸含量，結果發現藍豐品種藍莓酒中的綠原酸含量遠高于其他酚酸。整體而言，大多數酚酸，如沒食子酸、β-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸等在傳統法藍莓酒中的含量明顯少于二氧化碳浸漬法，且浸漬時間越長，酚酸含量越高。就酚酸而言，初步說明二氧化碳浸漬法相較于傳統法有利于酚酸類物質的浸出，且浸漬20 d或更長效果更優。

3 結論

本試驗以藍豐藍莓為研究對象，分別用二氧化碳浸漬法浸漬處理10 d、15 d、20 d后釀造出藍莓酒，重點研究有機酸和酚類物質。根據試驗結果來看，可初步得出以下結論：二氧化碳浸漬法和傳統法釀造的藍莓酒在酸類物質與酚類物質含量上有顯著差異（P＜0.05）。藍豐品種藍莓酒中最主要的有機酸為檸檬酸。二氧化碳浸漬法可以降低藍莓酒的酸度；在酚酸類物質方面，含量最高的酚酸為綠原酸。CO2浸漬法所釀藍莓酒酚酸含量高于傳統法，且浸漬天數越多的酒樣酚酸含量越高（P＜0.05），初步說明二氧化碳浸漬法可以加強酚酸物質的浸出。總黃酮與總花色苷含量均為浸漬法高于傳統法（P＜0.05），但傳統法的總酚含量高于浸漬法。

綜合而言，二氧化碳浸漬法能夠使酒體酸度降低，酚類、色素浸出減少，使口感更加協調柔順，易受到廣大消費者的青睞。綜合考慮生產時間與成本，CO2浸漬15 d為宜。

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