基于響應面法優化一株海洋綠藻胞內多糖提取工藝

付婷婷，馬 寧，蒙健宗，張云開*

（廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

多糖由于其特殊結構而具有多種不同于單糖的生化特性，如增稠、乳化、保水、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等[1-3]，被廣泛應用于紡織、化妝品、保健品、醫藥等行業中[4-6]。目前，多糖大多是從高等植物、細菌、真菌、動物和大型藻類中提取的，而對生長速度快、光合效率高、適應性強的海洋微藻中的多糖浸提工藝和條件優化的研究較為少見[7-8]。據報道，海洋微藻多糖成膜性能良好，具有一定保濕性，可作為功能性物質添加于食品、化妝品中[9-10]。在免疫學研究方面，海洋微藻多糖能促進淋巴細胞的增殖與分化、刺激巨噬細胞的吞噬、促進細胞因子、抗體的產生[11]。

早期，提取多糖采用提取效率極低的水提醇沉法，后發展了酸或堿提法，而酶法、超聲波和微波輔助法，雖提取效果好，但成本高、能耗大。多數糖類物質含有較多的極性基團，使其易溶于稀酸、稀堿和水，但是酸性環境會使多糖中的糖苷鍵發生斷裂[12-13]，因此選擇熱堿浸提法提取微藻多糖。

在工藝優化方面，響應面法具有試驗周期短、回歸方程精度高，可以研究多種因素間交互作用等優點[14-16]，被廣泛應用于微生物培養條件的優化。因此，采用屬于響應面法的Box-Behnken試驗，結合Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗，對一株自主篩選的富含胞內多糖的海洋綠藻，進行胞內多糖熱堿浸提工藝的優化，確定最佳工藝條件，為進一步開發利用該海洋綠藻胞內多糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻（Chlorella vulgaris）命名為BH95：自廣西合浦紅樹林海水中分離純化。

TAP（Tris-acetate-phosphate）海水培養基：NH4Cl 0.375g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，CaCl2·2H2O0.05g/L，K2HPO40.108g/L，KH2PO40.054g/L，Tris2.42g/L，冰醋酸1.0mL，微量元素[17]1.0mL，滅菌海水鹽度34.47‰定容至1L，自然pH。

體積分數為95%乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉（NaOH）及其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PL303電子天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；LRH-250A生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司；GL-21M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；FD-3/4冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠；Uvmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻的培養

將分離純化的單藻克隆，接種于含100 mL培養基的250 mL三角瓶中培養5 d，再以1∶10的接種量（V/V）轉接于含1 000 mL培養基的3 000 mL三角瓶中擴大培養。培養條件：生化培養箱溫度（25±2）℃，光照強度4 000 lx，每天光照21 h，黑暗3 h，人工搖動3次。

擴大培養10 d至穩定期后，離心收集藻細胞，冷凍干燥，保存備用。

1.3.2 小球藻多糖提取

采用熱堿浸提法提取小球藻多糖。稱取一定質量的干燥藻粉，與1.50%的NaOH溶液按料液比1∶20（g∶mL）混合，80℃水浴2.00 h；5 000 r/min離心15 min，取上清液加入體積分數為95%的乙醇，醇沉比1∶3（V/V），4℃靜置過夜；5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，待沉淀干燥后復溶于蒸餾水中，制成小球藻粗多糖溶液。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制及樣品多糖的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[18-19]進行測定，葡萄糖標準曲線繪制：準確稱取100 mg于105℃干燥至質量恒定的葡萄糖，溶解并用蒸餾水定容至1 000 mL，配制質量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL溶液于干燥試管中，以蒸餾水補齊至1.0 mL，然后加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸進行顯色反應，搖勻冷卻，室溫靜置20 min，以1.0 mL的蒸餾水作為空白對照，于波長490 nm處測定其吸光度值。以葡萄糖標準曲線回歸方程，計算樣品中多糖質量濃度。多糖提取率計算公式如下：

式中：Y表示胞內多糖提取率，%；c表示由標準曲線得出的多糖質量濃度，μg/mL；V表示提取定容后的總體積，mL；W表示干藻粉質量，mg。

1.3.4 單因素試驗

以多糖提取率（Y）為響應值，分別研究提取時間（1.00 h、2.00 h、3.00 h、4.00 h、5.00 h、6.00 h、）、NaOH 質 量 分 數（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、提取溫度（50 ℃、60 ℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、乙醇體積分數（55%、65%、75%、85%、95%、100%）、醇沉比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（V/V））對海洋綠藻胞內多糖提取率的影響。

1.3.5 Plackett-Burman試驗設計

根據單因素試驗，對提取時間（A）、NaOH質量分數（B）、料液比（C）、提取溫度（D）、乙醇體積分數（E）、醇沉比（F）6個因素進行Plackett-Burman試驗設計[20]，以多糖提取率（Y）為響應值，通過Design-Expert.V8.0.6軟件對試驗結果進行主效應分析，試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.6 最陡爬坡試驗設計[21]

根據Plackett-Burman試驗結果設計最陡爬坡試驗，各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向，以最快速逼近最佳區域。因素的取值根據各因素效應的正負和大小確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。找出多糖提取率最高的條件，即為響應面分析的中心點。

1.3.7 響應面法優化試驗

根據最陡爬坡試驗結果，以最陡爬坡試驗中多糖提取率最大組作為試驗中心點，各因素分別取高水平（+1）、中心點（0）、低水平（-1）3個水平。采用Box-Behnken中心組合設計原理設計響應面試驗，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以葡萄糖標準溶液質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

由圖1可知，葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：Y=0.006 74X-0.021 35；相關系數R2=0.997 91，結果表明葡萄糖質量濃度和吸光度值呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 BH95胞內多糖提取工藝單因素試驗結果

分別研究提取時間、NaOH質量分數、料液比、提取溫度、乙醇體積分數、醇沉比等6個因素對BH95胞內多糖提取率的影響，各影響因素試驗結果如圖2所示。

由圖2A和2D可知，提取時間和提取溫度對多糖提取率的影響趨勢相同，隨時間的延長、溫度的提高，提取率均表現為先上升后下降，分別在3 h、70℃時達到最大，因此，多糖提取時間選擇3 h，提取溫度選擇70℃。圖2B、2F中，在一定NaOH質量分數和醇沉比范圍內，多糖提取率均以相對穩定的速率增加，當NaOH質量分數超過2.5%，由于堿濃度過高，多糖降解，提取率有所下降；而醇沉比達到1∶3（V/V）時，提取率開始趨于平緩，綜上分析，選擇NaOH質量分數2.5%，醇沉比1∶3（V/V）。圖2C中，隨著堿液加入體積的增大，提取率不斷增大，當料液比達到1∶25（g∶mL）后，多糖提取率有一定范圍波動。考慮到綜合利用和節約成本，故料液比選擇1∶25（g∶mL）。由圖2E可知，當乙醇體積分數在55%～75%范圍內變化時，多糖提取率極低，且沒有明顯變化；乙醇體積分數為75%時，多糖提取率突然增加，在乙醇體積分數為95%時達到最大，后趨于穩定，故選擇乙醇體積分數為95%。

圖2 提取時間(A)、NaOH質量分數(B)、料液比(C)、提取溫度(D)、乙醇體積分數(E)和醇沉比(F)對多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time(A),NaOH concentration(B),solid-liquid ratio(C),extraction temperature(D),ethanol concentration(E)and extraction solution to ethanol ratio(F)on polysaccharide extraction yield

2.3 Plackett-Burman試驗設計及結果

依據單因素試驗結果，每個因素設置高（+1）、低（-1）兩個水平，進行Plackett-Burman試驗。Plackett-Burman試驗設計及響應值結果見表3，各因素顯著性及方差分析結果見表4。

將表3試驗結果進行方差分析，結果見表4。PB試驗模型顯著（P＜0.05）。由效應值可知，提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、醇沉比表現為正效應，NaOH質量分數、料液比表現為負效應。分析貢獻值和P值可得，A、B、D、E4個因素貢獻值較大且P＜0.05，其對多糖提取率貢獻大小依次為B＞D＞A＞E，即NaOH質量分數＞提取溫度＞提取時間＞乙醇體積分數。選擇前3個為主效應因素進行下一步試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

2.4 最陡爬坡試驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗結果，以主效應因素效應值方向為爬坡方向，固定其他因素料液比1∶25（g∶mL）、乙醇體積分數95%、醇沉比1∶3（V/V），進行最陡爬坡試驗。試驗設計及結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

由表5可知，第3組的多糖提取率最高，為5.31%。因此選擇第三組的水平為響應面的中心點，即NaOH質量分數1.5%、提取溫度70℃、提取時間3.5 h。

2.5 響應面試驗結果與分析

2.5.1 小球藻BH95胞內多糖提取率響應面試驗設計及結果

根據最陡爬坡試驗確定了重要影響因素的取值區間。采用Box-Benhnken中心組合設計原理設計3因素3水平響應面優化試驗，試驗設計與結果見表6，回歸模型方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

根據表6試驗結果，運用軟件Design-Expert.V8.0.6對響應值進行多元回歸擬合并進行方差分析，得到小球藻BH95胞內多糖提取工藝參數回歸方程為：

Y=6.59+0.40X1+0.87X2-0.05X3-0.33X1X2-0.29X1X3-0.91X2X3-0.85X12-1.37X22-0.55X32

由表7可知，該模型的決定系數R2=0.971 4＞0.9，變異系數（coefficient of variation，CV）為6.10%＜10%，信噪比RSN=15.380＞4.0，說明該方程相關性良好、可靠性較高、試驗穩定性好、試驗操作可信。模型極顯著（P＜0.01），說明模型充分擬合試驗數據，失擬項P值為0.281 3＞0.05，不顯著，表明試驗的誤差較小，未知因素對試驗干擾少。綜上所述，該模型能較好地對小球藻BH95胞內多糖提取工藝參數進行分析和預測。

回歸模型中，因素X2、X12、X22及交互項X2X3影響極顯著（P＜0.01），X1、X32項影響顯著（P＜0.05），從F值可以看出，所選因素對多糖提取率的影響強弱次序為X2＞X1＞X3，即提取溫度＞NaOH質量分數＞提取時間。

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.5.2 響應面交互作用分析

根據回歸模型繪制響應曲面圖，以確定NaOH質量分數、提取溫度、提取時間3個因素對多糖提取率的影響，響應曲面圖及等高線見圖3。

三維響應曲面圖可以表示響應值與試驗因素的每個水平之間的函數關系，同時可從直觀角度獲取試驗設計中的最優工藝參數[22]。由圖3可知，NaOH質量分數、提取溫度、提取時間兩兩交互作用對多糖提取率的影響均呈拋物面型關系，且響應面均存在一個極大值點。其中提取時間與提取溫度之間的交互作用最為顯著。

2.5.3 最佳提取工藝條件的預測與驗證

經響應面法優化，軟件Design-Expert.V8.0.6分析得出小球藻BH95胞內多糖提取最佳工藝條件為NaOH質量分數1.61%、提取溫度74.5℃、提取時間3.02 h，此時多糖提取率預測值為6.85%。

為檢驗模型的可靠性，采用上述工藝條件進行驗證試驗，同時考慮到實際操作的可行性，將工藝條件修改為NaOH質量分數1.60%、提取溫度75℃、提取時間3.00 h，進行3次平行試驗，得到胞內多糖提取率為6.81%，實測值與預測值的相對誤差為0.58%。試驗結果與理論預測值接近，表明建立的數學模型對預測小球藻BH95胞內多糖提取條件準確可靠，具有一定實用價值。

圖3 NaOH質量分數、提取溫度與提取時間交互作用對多糖提取率影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interaction between NaOH concentration,extraction temperature and extraction time on polysaccharide extraction yield

3 結論

根據單因素試驗、Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗，篩選出了對多糖提取率影響顯著的因素：即NaOH濃度、提取溫度、提取時間，并確定最佳值區域。采用響應面優化試驗，通過Box-Behnken中心組合設計，建立了多糖提取率與各因素之間的數學模型，從而確定了BH95胞內多糖提取的最佳工藝參數為NaOH質量分數1.60%、提取溫度75 ℃、提取時間3.00 h、料液比1∶25（g∶mL）、乙醇體積分數95%、醇沉比1∶3（V/V）。此工藝條件下，BH95胞內多糖提取率達到6.81%。因此，將響應面法應用于小球藻胞內多糖提取工藝優化是可行的，同時為小球藻多糖及小球藻生物質資源的應用開發提供了一定理論參考。

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