人工栽培獼猴桃釀酒酵母篩選研究

王 燕，劉 娟

（樂山師范學院 生命科學學院，四川 樂山 614004）

獼猴桃被譽為維生素C之王，鮮果及其深加工產品都深受國內外消費者青睞[1]。隨著人工獼猴桃栽培技術的成熟與發展，栽培獼猴桃產量劇增，但獼猴桃不耐貯藏，尤其在生產旺季，給產地獼猴桃銷售造成困境，加大果實加工產品的開發，對于獼猴桃資源的利用有很大的意義和前景[2-5]。

如今獼猴桃酒的生產工藝大多是自然發酵或采用葡萄酒酵母、釀酒活性干酵母作為釀酒菌株，但自然發酵生產過程不易控制，難以實現規范化及大規模生產；而采用葡萄酒酵母、釀酒活性干酵母作為釀酒菌株，由于這些菌種并不是針對獼猴桃酒的生產工藝的特點開發出來的，釀酒產品效果并不好[6-7]。本研究從峨眉山地區生產的成熟野生獼猴桃中分離篩選出優良的獼猴桃釀酒酵母菌株MY-20[6]，然后以人工栽培獼猴桃為原料，分別以篩選菌株和MY-20為發酵菌株進行果酒發酵對比。期望篩選出產酸、產酒、口感及其他一些發酵特征均較優的、適合人工栽培獼猴桃為原料的釀酒酵母菌株。使之經后期馴化能成為適合獼猴桃工業釀酒的專用菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發酵原料

人工栽培獼猴桃：樂山地區市售。

1.1.2 實驗菌種

釀酒酵母菌株MY-20：樂山師范學院生命科學學院資源微生物實驗室。

1.1.3 培養基[3，6]

酵母菌種培養及篩選培養基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

酵母菌發酵液體培養基：含40%獼猴桃果汁，蔗糖2%。

1.2 儀器設備

CX41生物顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；WS-300恒溫搖床：德國WIGGENS公司；GHP-9080恒溫培養箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺：揚州慧科電子有限公司；YH110酒精計：青縣燕河儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃果汁液體培養基制備

先將獼猴桃進行分選，去雜物和霉爛果，再用流動水沖洗，去皮，在冰柜中預冷至10℃，迅速打漿，將勻漿轉入大燒杯中，加入果膠酶100 mg/L，密封燒杯口，室溫條件下酶解12 h。酶解結束后的漿液用4層紗布過濾，濾液置于燒杯中4℃靜置冷卻0.5 h。取上清液作為發酵培養基。將上述獼猴桃汁上清液分裝入已滅菌的發酵瓶，每瓶150 mL，然后加3 g蔗糖搖勻[8]，紫外燈照射1 h滅菌。

1.3.2 人工栽培獼猴桃酵母菌種的分離純化[3，6]

將成熟軟化的栽培獼猴桃切一小塊果皮放入獼猴桃果汁液體培養基中，室溫條件下（25～28℃）培養。每隔12 h觀察一次，選取感官判斷帶有明顯酒味的發酵試管，搖勻管內液體后梯度稀釋（10-1，10-2，……），然后把原發酵液與稀釋液分別涂布于無菌酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）平板，每個濃度各涂布10個平板，標記，28℃恒溫培養3 d，觀察菌落。挑選長勢較好，形態不相同，與MY-20也明顯不同的酵母菌落分別接種至無菌YEPD斜面，28℃恒溫培養。然后同樣條件平板培養，觀察記錄菌落菌苔形態，鏡檢確定并記錄細胞形態[2]。

1.3.3 不同酵母發酵對比

將從獼猴桃中篩選出的菌株與MY-20同時進行發酵培養。每種菌株分別接種3環到無菌獼猴桃果汁液體培養基中，恒溫搖床60 r/min，28℃培養。再分別測其產酒、產酸性能，并對其發酵液感官特性作出評價。

1.3.4 分析檢測

酵母菌株產酒力測定、發酵液的酸度測定[9]：按國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法；發酵液感官特性評價：感官評價[10-15]。

2 結果與分析

2.1 栽培獼猴桃酵母菌種的分離純化結果

據菌落的生長特征及顯微鏡下酵母細胞的觀察，篩選出3株產酒酵母菌，分別編號為ZMJ-1、ZMJ-2、ZMJ-1。各菌株生長及細胞形態記錄見表1。

表1 實驗室篩選菌株特征Table 1 Features of selected strains

2.2 菌株發酵過程中酸度變化測定結果

酸度是評判獼猴桃酒酵母菌發酵效果的一項重要指標。酸度過高會使獼猴桃酒口感不愉悅，酸度過低則使口味趨于平淡。所以，好的菌株應該是在發酵過程中使發酵液既具備一定的酸度，保證好的口感，又能在發酵過程中使發酵液的pH值不繼續降低[2]。

從剛剛接入菌種開始計時，測定發酵初（第0天）的發酵液pH，之后每間隔1 d測定一次。測得發酵液的pH值如圖1所示。

圖1 發酵時間對發酵液pH值的影響Fig.1 Effect of fermentation time on fermentation broth pH

由圖1可見，接種ZMJ-3的發酵液于第1天pH值出現下降，且之后一直維持低pH狀態。規模化生產中為保證生產效率，發酵果汁一旦濃縮，會造成發酵液酸性過強，會對生產過程在很大程度上造成不利影響。接種ZMJ-1培養基在發酵前2dpH呈下降趨勢，第3天開始上升，并趨于平穩，最終pH維持在3.67左右；接種MY20菌株的培養基pH值同樣在前2 d下降，在第3天開始上升，但上升速度較ZMJ-1慢，且最終pH也相對略低；接種ZMJ-2的發酵液在前3 d pH下降，最低pH達3.62，與ZMJ-3相同，雖于第4天pH出現上升，但pH值明顯低于ZMJ-1和MY-20。綜上所述，從發酵液的pH值變化方面考慮，ZMJ-1和MY-20較優。第2天接種ZMJ-1的發酵液pH值為3.64，MY-20的發酵液為pH 3.65，雖然前者略低，但差距并不明顯。第3天ZMJ-1的發酵液pH值為3.66，上升明顯，而MY-20發酵液為pH 3.65，明顯低于ZMJ-1。因此，從發酵pH值的變化角度考慮，ZMJ-1更快達到高值并趨于穩定，較為適宜。

2.3 菌株產酒精能力測定結果[2]

優良的釀酒菌株應該是產酒力達到某個所需酒精度（一般果酒酒精度在7%vol左右）的時間越短越好。按照酒精計法，分別于發酵第3天與發酵第5天測定發酵液酒精度，酒精度測量結果見表2。

從表2可見，ZMJ-1產酒能力最優，5 d后酒精度達到7.3%vol。MY-20于5 d后發酵液酒精度為6.8%vol，低于ZMJ-1，且與之前以野生獼猴桃為發酵液時（5 d后MY-20發酵液酒精度達7.8%vol）比較，相對較低[2]。這可能與栽培獼猴桃原料糖含量較野生獼猴桃低以及ZMJ-1來源于栽培獼猴桃內生菌株篩選分離，更能適應原料、生長較好有關。由此可見，若以栽培獼猴桃為釀酒原料，ZMJ-1在產酒力方面更有優勢。

表2 各菌株發酵結果Table 2 The fermentation results of strains

2.4 發酵過程中獼猴桃酒的感官評價[2]

表3 發酵第3天及第5天發酵液感官評價Table 3 Sensory evaluation of fermentation broth after fermentation for 3 d and 5 d

由表3可知，4株菌株在發酵過程中均出現了不同程度的泡沫。ZMJ-1在發酵第3天出現少量泡沫，發酵第5天泡沫量減少，表面只有極少量泡沫。其次是MY-20，發酵第3天出現少量泡沫，發酵第5天表面泡沫量較其第3天少，比ZMJ-1多。ZMJ-2雖然在第5天表面泡沫量與MY-20相當，但是第3天出現了較多泡沫，這在工業上是不利因素。ZMJ-3第3天出現少量泡沫，第5天泡沫量大。因此，在產生泡沫量方面，ZMJ-1表現最優。從發酵液感官特性來看，ZMJ-2和ZMJ-3二者較差，在第5天均出現了不同程度的敗酸味。第5天二者發酵液均具有澄清、有光澤的優良品質，且具有一定的果味和酒味適宜。因此，從感官評價考慮，ZMJ-1較為適宜。

3 結論

試驗從栽培獼猴桃原料本身分離篩選出了3株釀酒酵母ZMJ-1、ZMJ-2、ZMJ-3。3株酵母均具有一定的產酒能力。

從與實驗室已有從野生獼猴桃原料中分離的優良菌株MY-20一同進行了栽培獼猴桃為原料的發酵實驗后發現：

ZMJ-1和MY-20在發酵過程中發酵液pH值變化均為先小幅下降，然后上升至pH 3.67左右，超過原液pH值。但ZMJ-1發酵液pH值上升更迅速，更快趨于穩定，所以從發酵pH值的變化角度考慮，ZMJ-1優于MY-20。

發酵5 d后ZMJ-1發酵液酒精度達到7.3%vol。MY-20達到6.8%vol，皆接近果酒適宜酒精度。但MY-20產酒能力低于ZMY-1，也低于之前以野生獼猴桃為發酵原料產酒（5 d后MY-20發酵液酒精度達7.8%vol）[2]。這可能與栽培獼猴桃原料糖含量較野生獼猴桃低，以及MY-20較ZMJ-1不能更好的適應原料，生長受到不良影響有關。由此可見若以栽培獼猴桃為釀酒原料，ZMJ-1更優。

ZMJ-1和MY-20發酵液在感官性狀方面表現優良，第5天二者發酵液均具有澄清、有光澤的優良品質，且具有一定的果味和酒味適宜。從感官品質考慮，ZMJ-1略優于MY-20。

綜上，若以栽培獼猴桃為原料規模化釀造獼猴桃酒，ZMJ-1和MY-20均為較優良釀酒菌株，但ZMJ-1在發酵性能上優于MY-20，因此，ZMJ-1經過后期馴化改良，有望成為工業化生產獼猴桃酒的釀酒菌株。

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