黑曲霉固體發酵三七藥材的皂苷變化研究

閆炳雄，許文迪，賀 帥，邱智東，王偉楠*

（長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

三七（Panax notoginseng）又名田七，為五加科人參屬多年生草本植物的根莖，是傳統名貴中藥材之一，具有化瘀止痛，活血定痛的功效，對出血癥，跌打損傷，瘀血腫痛，虛損勞傷等病癥療效顯著。現代研究表明三七的主要活性物質為皂苷類成分。其藥理作用主要包括對心腦血管的影響、對中樞神經系統的影響、對血液的影響、對免疫系統的影響和抗腫瘤等方面[1-8]。三七中皂苷含量為6%，遠高于其他五加科植物的總皂苷含量[9]，但活性和生物利用度較好的稀有皂苷類成分如人參皂苷Rd，Rh1，Rh2，Rg3，CK等含量極少，甚至不可檢出，因此如何提高稀有皂苷含量成為了三七深度開發利用的關鍵問題。

應用微生物發酵技術提高中藥活性成分含量，改變物質基礎組成是中藥研究領域的熱點內容，因其效率高、無污染，具有較好的應用前景。中藥材經過微生物發酵之后，化學成分發生了明顯的變化，某些大分子降解成小分子，易于被人體吸收，提高藥材生物利用度；某些藥物增加了有效成分或有效部位的含量，改善了藥效[10-16]。黑曲霉（Aspergillusniger）是環境中的常見菌種，生長速度快，環境適應能力強，且生物安全性較高，非常適用于在中藥基質上生長。前期試驗發現黑曲霉在潮濕的三七藥材中很容易生長。所以本研究利用黑曲霉對三七藥材進行固體發酵，采用高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（high performance liquidchromatography-quadrupole-timeofflight-tandemmass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS/MS）方法，對發酵產物中主要活性成分皂苷含量的變化進行檢測，為三七藥材的開發和利用及相關藥物研究提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三七藥材購于吉林國安藥業有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、麥芽浸膏、馬鈴薯浸出粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；七水合硫酸鎂、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硝酸鈉甲醇均為分析純：北京化工廠；乙腈、甲酸均為色譜純：美國Thermo Fisher公司。人參皂苷Rb1（批號：MUST-12102301）、人參皂苷Rg1（批號：MUST-13041301）、人參皂苷Rd（批號：MUST-15020910）、人參皂苷Rh1（批號：MUST-15020914）、人參皂苷Rh2（批號：MUST-14062410）、人參皂苷CK（批號：MUST-15012711）、人參皂苷Rg3（批號：MUST-14041211）、人參皂苷F1（批號：MUST-14101610）標品：成都曼斯特生物科技有限公司；人參皂苷F2（批號：GR-133-131224）、三七皂苷R1（批號：GR-133-131109）、三七皂苷R2（批號：GR-133-131209）標品：南京廣潤生物制品有限公司。

1.1.3 培養基

斜面培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。自然pH，121℃滅菌20 min。

液體種子培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。自然pH，121℃滅菌20 min。

固體發酵培養基：粉碎三七藥材粉末（過10目篩），1.5%CaCO3，加入50%的蒸餾水，攪拌均勻121℃滅菌60 min。

1.1.4 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）CICC 2124：中國工業菌種保藏管理中心，PDA培養基斜面4℃保存。

1.2 儀器與設備

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent 6520 Q-TOF質譜儀：美國Agilent公司；DZX180微生物培養箱：上海艾測電子科技有限公司；ZD-88恒溫冷凍振蕩器、HSP150B恒溫恒濕培養箱：金壇市天竟實驗儀器廠；TG328A（S）分析天平：北京斯達恒通科技有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BPZ-6930LC真空干燥箱：上海一恒實驗儀器總廠；FW177中草藥粉碎機：天津市泰特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的復壯、復蘇及種子液的制備

將黑曲霉斜面從低溫冷藏冰箱中取出，迅速移至30℃水浴中加熱30 min后，擦干試管表面，將斜面放置在28℃的微生物培養箱中12 h后，即可取出備用。將復蘇的黑曲霉菌于液體培養基中，于28℃恒溫培養培養5 d，即得液體種子培養基。

1.3.2 菌體培養

取三七藥材粉碎（過10目篩），加入0.5%無機鹽CaCO3，加入50%的蒸餾水，攪拌均勻，分裝于250 mL廣口三角瓶中，密塞瓶口，放入高壓蒸汽滅菌器中保持溫度121℃，滅菌60 min，取出，自然冷卻至室溫，在生物安全柜中接種黑曲霉菌液適量，待接種完成后放入溫度為28℃，相對濕度65%的恒溫恒濕培養箱中，培養20 d。

1.3.3 發酵產物供試品及對照樣品的制備

將發酵至終點的發酵物從培養瓶中取出，置于減壓真空干燥箱60℃干燥，用中草藥粉碎機粉碎。取本品粉末（過65目篩）0.2 g，精密稱定，精密加入甲醇4 mL，稱質量，超聲（150 W，40 kHz）處理1 h，冷卻后再稱質量，用甲醇補足減少的質量，搖勻，過濾，取續濾液，用0.22 μm微孔濾器過濾，作為供試品溶液。同法制得三七藥材對照品溶液。

皂苷含量變化計算公式如下：

1.3.4 液相色譜-質譜分析

（1）高效液相色譜條件

采用ZORBAXSB-Aq色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的程序進行梯度洗脫，進樣量10 μL，流速1 mL/min。

表1 三七發酵產物高效液相色譜洗脫梯度Table 1 HPLC chromatographic elution condition ofPanax notoginsengfermentation product

（2）質譜條件

電噴霧離子源（electronic sprayion，ESI）；電離模式：負離子模式；噴霧器壓力：207kPa；干燥氣（N2）流速：10L/min；干燥氣溫度：350℃；毛細管電壓：3500V；碎裂電壓：175V；錐孔電壓：65 V；質量檢測范圍：300～1 400 m/z。

2 結果與分析

2.1 色譜峰歸屬

三七混標溶液及固體發酵產物進行鑒定分析，其液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）分析得到的總離子流色譜圖見圖1，各組分鑒定結果見表2。

由圖1和表2可知，三七藥材經黑曲菌固體發酵后主要活性成分發生較大變化。根據分子量和結構裂解規律，推斷1～13號色譜峰均為皂苷類成分。經過標準品對照，色譜峰1、2、3、4、5、6、11、12、13分別鑒定為三七皂苷R1（notoginsenoside R1）、人參皂苷Rg1、三七皂苷R2（notoginsenoside R2）、人參皂苷Rh1、F1、Rd、F2、Rg3、CK；7號峰的[M-H]m/z=751.469 4計算分子式為C41H68O12，初步推測為三七皂苷T5（notoginsenoside T5）；8、9、10號峰的[M-H]m/z值分別為619.432 9、619.432 4、619.432 3，計算分子式均為C36H60O8，為三個同分異構體，結合目前已有的文獻報道，初步推測為人參皂苷Rk3、Rh4和Rh16。

圖1 混標(A)和發酵產物(B)的皂苷化合物分析LC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of the mixed standards(A)and fermentation product(B)for saponin compounds analysis by LC-MS

表2 色譜峰鑒定Table 2 Identification of the chromatographic peaks

2.2 三七藥材發酵前后主要皂苷類成分的含量變化

對三七藥材及固體發酵產物進行鑒定分析，其LC-MS分析得到的總離子流色譜圖見圖2，通過液質聯用的定量模式，記錄不同色譜峰發酵前后的峰面積變化，三七藥材及三七發酵產物皂苷峰面積對比結果見表3。

圖2 三七發酵前(A)及發酵后(B)的皂苷化合物分析的LC-MS總離子色譜流圖Fig.2 TIC of saponin compounds ofPanax notoginsengbefore(A)and after(B)fermentation for saponin compounds analysis by LC-MS

表3 三七藥材及發酵產物皂苷峰面積對比Table 3 Peak areas of different saponins inPanax notoginseng and the fermentation products

由圖2及表3可知，三七經過發酵之后，原生苷的含量均有不同程度的降低，而極性較低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高。通過計算，原藥材中含量較高的人參皂苷Rb1幾乎全部轉化生成其他物質，在發酵產物中已不可檢出；人參皂苷Rg1的含量也有較大幅度的降低，經計算為62.19%；而三七皂苷R1的含量變化不大，僅降低了3.87%；三七皂苷R2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk3的含量分別提高484.65%、1513.57%、121.98%、21.20%、208.73%；并且產生了生物利用度更好的稀有皂苷類成分人參皂苷F1、人參皂苷Rh4、三七皂苷Rh16、三七皂苷T5、人參皂苷Rg3和人參皂苷CK，推測均為生物轉化產物。

3 結論

黑曲霉是工業上常用的發酵菌種，具有遺傳系統穩定，生長迅速，酶系豐富等特點，其中尤以糖苷酶較為豐富，因此，利用黑曲霉對皂苷類成分進行結構改造具有良好的發展前景。在本實驗中，三七藥材經黑曲霉發酵后，皂苷類成分產生了顯著的變化，利用標準品對其中主要的皂苷進行了鑒定，然后通過查閱大量三七藥材及其加工產品的成分分析文獻[17-22]，對另外幾個皂苷的結構特點、極性大小和在ZORBAX反相色譜柱上的相對保留時間，進行歸納總結，最終判斷7號峰為三七皂苷T5，8號峰為人參皂苷Rk3，9號峰為人參皂苷Rh4，10號峰為人參皂苷Rh16；通過比較發酵前后三七藥材的活性物質，發現藥理活性和生物利用度更好的稀有皂苷含量明顯增加，使得到的發酵產物展現出較高的臨床應用價值和挖掘潛力，為指導三七藥材的開發和利用以及稀有皂苷的大規模生產提供理論依據。

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