葡萄糖酸鈉酶法生產工藝研究

王道會，武玉民，張云鵬*，劉 玲

（1.青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042；2.青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400）

葡萄糖酸鈉又名五羥基己酸鈉，分子式為C6H11O7Na[1]。由于無毒、熱穩定性好等特點，在建筑工業、食品、醫藥等方面有著廣泛的應用[2-4]。其傳統的生產方式主要有黑曲霉生物發酵法、多相催化氧化法、電解氧化法等[5-7]。隨著生物技術的不斷發展，利用酶法生產葡萄糖酸鈉已經成為可能，并且更具先進性。酶法生產工藝主要是利用葡萄糖氧化酶[8-9]和過氧化氫酶直接將葡萄糖底物轉化為葡萄糖酸，經中和制得葡萄糖酸鹽系列產品。此方法具有不需要菌種、不受各種輔料濃度影響[10-11]、節省能源、工藝簡化、操作方便、底物濃度高且純度好、便于提取精制等特點。

本實驗利用葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶生產葡萄糖酸鈉，通過實驗探討了最佳的工藝條件，并與黑曲霉發酵法在發酵時間、產品質量等方面進行對比，為葡萄糖酸系列產品的生產探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖（工業級）：西王集團有限公司；葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD），酶活力10 000 U/g、過氧化氫酶（catalase，CAT），酶活力60 000 U/g：天津諾維信酶制劑公司；302#活性炭：溧陽市華東活性炭有限公司；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；尿素：山東省寧津縣化工有限公司。

1.2 儀器與設備

FZ33-FZ-Q-5L5L全自動發酵罐：西華儀科技有限公司；RE-201D旋轉蒸發器：上海鷹迪設備有限公司；FE20pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖酸鈉合成原理[12]

1.3.2 合成方法

將葡萄糖溶解于水配制成3 L質量分數為35%的葡萄糖漿，調節pH至5.5，加入葡萄糖氧化酶3～5 mL/g（以葡萄糖質量的1%計），攪拌均勻后加入過氧化氫酶2～5 mL/g（以葡萄糖質量的0.75%計），調節葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶的添加量，反應溫度及反應時間等以探究最優的葡糖氧化酶及過氧化氫酶的反應條件。

1.3.3 葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶反應條件優化

反應溫度實驗：控制相同的反應初糖含量33%，在酶添加量、罐壓、風量、攪拌轉速保持一致的情況下，測定25℃、28℃、32℃、35℃、40℃條件下20 h的殘糖含量。

攪拌轉速實驗：控制相同的反應初糖含量33%，在酶添加量、風量、罐壓、反應時間一致的情況下，測定100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、220 r/min條件下20 h時的殘糖含量。

風量實驗：控制相同的反應初糖含量33%，在酶添加量、罐壓、攪拌轉速、反應時間一致的情況下，測定1 200 m3/h、1400m3/h、1600m3/h、1800m3/h條件下20h時的殘糖含量。

酶添加量優化：控制相同的反應初糖含量33%，在罐壓、通風量、轉速、反應時間保持一致的情況下，調節發酵葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的添加量，測定最終殘糖含量。

1.3.4 黑曲霉發酵法生產葡萄糖酸鈉

黑曲霉發酵法所用發酵配方為葡萄糖350 g/L，酵母浸粉0.25g/L，尿素2g/L，pH6.0。在溫度31℃，風量1600m3/h，轉速220 r/min條件下進行發酵，待發酵殘糖降至0.7 g/100 mL后結束發酵，并同酶法發酵法進行比較。

1.3.5 殘糖測定方法

按照參考文獻[13]的方法進行。

1.3.6 酶法及發酵法葡萄糖酸鈉提取實驗及比較

對發酵液進行處理，取酶法與發酵法生產發酵液各2 L，分別調pH值，均調至6.6～7.2。將調好pH值的發酵液分別添加4.6 g 302#活性炭，水浴升溫至60～70℃保溫脫色40 min，過濾。對比發酵液的脫色率及過濾時間。按照參考文獻[14]的方法測定溶液脫色率。對脫色清液進行濃縮，濃縮至起晶，過濾，得濾餅用蒸餾水洗滌后放于烘箱中烘干。對晶體進行稱量分析，對比晶體質量。按照參考文獻[15]的方法測定葡萄糖酸鈉的質量。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶及過氧化氫酶反應條件優化

2.1.1 反應溫度對酶法殘糖含量的影響

表1 反應溫度對殘糖含量的影響Table 1 Effect of reaction temperature on residual sugar content

通過表1可以看出，在25～32℃時，殘糖含量隨著溫度的升高而逐漸降低，但當溫度＞32℃時，殘糖含量隨著溫度升高而升高，而且在不同溫度條件下殘糖含量差別較大，32℃時殘糖含量最低。這是因為上述兩種酶是蛋白質，蛋白質對反應溫度特別敏感，溫度升高會加快反應速度，但是隨著溫度的繼續增加，酶活會有所降低甚至被滅活；溫度過低，酶的活性受到抑制，反應速度同樣會降低。因此最適反應溫度為32℃。

2.1.2 攪拌轉速對殘糖降解的影響

表2 攪拌轉速對殘糖含量的影響Table 2 Effect of stirring speed on residual sugar content

通過表2可以看出，在100～220 r/min時，增加轉速殘糖含量逐漸減少，在190～220 r/min時殘糖降低不明顯，隨著轉速繼續增加，殘糖含量反而呈上升趨勢，這可能是由于隨著攪拌轉速的增加，酶與糖液接觸頻繁，反應速率增快，但繼續增加攪拌轉速對酶造成一定的破壞，殘糖含量降低，考慮成本及殘糖降解效果，選擇攪拌轉速190 r/min為宜。

2.1.3 通風量對殘糖含量的影響

表3 通風量對殘糖含量的影響Table 3 Effect of air volume on residual sugar content

通過表3可以看出，隨著通風量的不斷升高，殘糖含量呈降低趨勢，但是風量從1 600 m3/h升至1 800 m3/h時，殘糖降解速率不明顯，這是因為隨著風量的提高，酶與糖液的接觸更加頻繁，增加了單位時間的接觸面，但當風量再高時，酶與糖液的接觸面積已經不能再提高，使殘糖降解速率不再增加。考慮成本因素，控制風量在1 600 m3/h即可。

2.1.4 酶添加量對殘糖降解的影響

表4 葡糖氧化酶添加量對殘糖含量的影響Table 4 Effect of GOD addition on residual sugar content

通過表4可以看出，在固定過氧化氫酶添加量為3 mL/g的情況下，隨著葡萄糖氧化酶含量的增加，殘糖含量降低，但是在4 mL/g時已經達到飽和，再增加對最終殘糖含量的降低不明顯。因此固定葡萄糖氧化酶4 mL/g，調節過氧化氫酶的含量。

在固定葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g的情況下，隨著過氧化氫酶含量的增加，殘糖含量降低，但是在3 mL/g時已達到飽和，完成催化作用，再增加對最終殘糖降低不明顯。通過表4和表5，最終選擇葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g，過氧化氫酶添加量在3 mL/g。

2.2 酶法與發酵法生產葡萄糖酸鈉的對比

2.2.1 生產周期及最終發酵殘糖的對比

圖1 酶法和生物法對發酵時間及殘糖含量的影響Fig.1 Effect of enzyme and fermentation method on fermentation time and residual sugar content

通過圖1可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵法與酶法的發酵液殘糖含量都降低，但是酶法的反應時間更快，發酵周期更短。這可能是由于酶法直接與培養液接觸，直接催化反應的發生，而微生物法則需要由微生物生長并產酶，需要一定的時間，所以發酵進程前期較緩，中期速度較快，在10～18 h達到最高峰，后期則因菌種老化死亡，發酵變緩。酶法較發酵法生產周期上要縮短5～8 h的時間，這樣可以節省大量的能耗，同時還可以省去菌種培養以及實驗室等輔助生產設施。

2.2.2 酶法與發酵法發酵液脫色效果及過濾時間對比

表5 過氧化氫酶添加量對殘糖含量的影響Table 5 Effect of CAT addition on residual sugar content

由表5可以看出，在相同活性炭添加量、相同脫色時間的情況下，酶法比發酵法得到的發酵液脫色率更高。這是由于發酵法在發酵過程中菌體會產生色素等雜質，而酶法生產則沒有這些雜質，因此在相同情況下，酶法的脫色效果比發酵法要好。

在相同活性炭添加量及珍珠巖添加量的情況下，酶法過濾速度要比發酵法快出幾倍。這是由于酶法在反應過程中不產生菌絲體等蛋白質物質，可以減輕過濾的壓力，從而提高過濾速度。

2.2.3 酶法與發酵法的產品質量對比

表6 酶法與發酵法發酵液脫色效果對比Table 6 Comparison of enzyme and fermentation method on fermented liquid decoloration effect

由表6可以看出，酶法生產的產品質量比菌種發酵好，這是由于在菌種發酵過程中需要添加各種營養鹽等輔料以及菌體自溶等因素產生的很多物質在后續提取過程中有的難以提取出來，致使產品純度低，還原物含量高，pH值偏低。

3 結論

酶法生產葡萄糖酸鈉的最佳工藝條件為：在溫度32℃、轉速190 r/min、通風量1 600 m3/h、葡萄糖氧化酶添加量為4 mL/g，過氧化氫酶添加量在3 mL/g的條件下最好，殘糖降解速度最快。

通過對比酶法與發酵法的生產時間、生產殘糖、脫色效果、過濾時間、產品質量等方面，確定了酶法生產葡萄糖酸鈉比發酵法生產效果好。

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