哈密瓜中內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定

趙海霞，王 晨，孔 雙，劉 婭*

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

植物內(nèi)生細(xì)菌（endophyte bacteria）是指能在健康植物組織內(nèi)棲居，對(duì)植物不造成實(shí)質(zhì)性危害而與植物建立了和諧聯(lián)合（compatible association）關(guān)系的微生物[1-2]。植物與其內(nèi)生菌的這種共生現(xiàn)象在生物進(jìn)化過(guò)程中歷史悠久而普遍，大部分植物內(nèi)生菌在從宿主獲得穩(wěn)定生活環(huán)境的同時(shí)，還可增強(qiáng)或賦予宿主抗病、抗干旱、固氮等能力，或通過(guò)其代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)。已有研究表明，幾乎每種植物都具有豐富的內(nèi)生菌存在，很多植物的內(nèi)生菌是新屬或者新種，但目前研究的植物種類僅幾百種，因此還有巨大的內(nèi)生菌資源寶庫(kù)等待開(kāi)發(fā)利用。新疆地處祖國(guó)西部邊陲，多樣化的氣候和環(huán)境條件勢(shì)必造成新疆植物內(nèi)生菌資源的特異性和多樣性，加強(qiáng)新疆特色植物內(nèi)生菌的研究具有重要意義[3-4]。

哈密瓜（Cucumis melovar.saccharinus），是甜瓜的一個(gè)品種，出產(chǎn)于晝夜溫差較大的新疆，以哈密所產(chǎn)最為著名[5]。哈密瓜對(duì)生存環(huán)境及氣候條件有著其特殊的適應(yīng)能力，與其對(duì)內(nèi)生菌種群的選擇存在著一定的相互關(guān)系。為了解哈密瓜內(nèi)生菌的生物多樣性，有必要對(duì)其中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，從而為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生菌與宿主的關(guān)系及內(nèi)生菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

哈密瓜：新疆伽師2號(hào)瓜；馬鈴薯：石河子市好家鄉(xiāng)超市。

葡萄糖、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、甘油、無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。以上試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-98型恒溫振蕩器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；EH20A plus型電爐：北京伯泰科儀器有限公司；HPX-9272 MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠；SW-CG-1C V型微生物潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；BCD-265F型冰箱：海爾公司；BS2000S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CX21型光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程

采樣→表面消毒→內(nèi)生細(xì)菌分離、純化→形態(tài)觀察→分子鑒定→種屬確定

1.3.2 采樣

選購(gòu)新疆地域特色明顯的伽師2號(hào)瓜，瓜成熟度8～9成，表面健康，無(wú)病害、無(wú)機(jī)械傷。

1.3.3 樣品的表面消毒與分離純化

將采集到的上述樣品用自來(lái)水沖洗干凈，瀝干后放入已經(jīng)過(guò)紫外燈殺菌的超凈臺(tái)。將哈密瓜表面用酒精棉球擦拭三遍，用滅菌處理的小刀取哈密瓜的瓜皮、淺層肉、深層肉、瓜瓤、瓜籽等大小為5 cm2的組織塊，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗，將最后一遍沖洗的無(wú)菌水涂布于PDA培養(yǎng)基上，作為表面消毒對(duì)照。分別將樣品切成1 cm的小段，貼于PDA培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察培養(yǎng)效果[6-7]。

取緊貼組織塊邊緣生長(zhǎng)的菌落及時(shí)轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取不同的菌落轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基上，重復(fù)劃線分離操作，直至將其純化為單一菌落，并進(jìn)行編號(hào)[8-9]。

1.3.4 菌種的保藏

將菌種進(jìn)行試管斜面保藏和甘油管保藏。

1.3.5 內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)觀察

觀察單一菌落的表面形態(tài)，邊緣形狀，隆起形狀和透明度[10]。

1.3.6 內(nèi)生細(xì)菌的顯微形態(tài)觀察

使用革蘭氏染色法，將細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-），并在高倍鏡下觀察所分離到的菌體形態(tài)[11]。

1.3.7 菌株的16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株經(jīng)分離純化后，送往北京市理化分析檢測(cè)中心測(cè)序，反應(yīng)引物為27f/1492r，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃，30 s；退火48℃，30 s；延伸72℃，1 min；終延伸72℃，10 min；40個(gè)循環(huán)。依據(jù)測(cè)序結(jié)果，用Blast搜索程序從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比。

系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura模型估算，用MEGA5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）聚類分析，并構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離、純化

2.1.1 哈密瓜內(nèi)生菌的組織塊培養(yǎng)

將哈密瓜的皮、淺層肉，深層肉，瓜籽，瓜瓤分別在NA培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各組織塊周圍均長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明各組織塊中均存在內(nèi)生菌。

2.1.2 哈密瓜內(nèi)生菌的分離純化

組織塊周圍的菌經(jīng)分離純化后得到菌株21株，其中果皮中分離出5株，淺層肉和深層肉中各分離出4株，瓜瓤和瓜籽中分別分離出2株和6株。皮和籽中分離的最多，占總菌數(shù)的57.2%。實(shí)驗(yàn)中分離的內(nèi)生菌株數(shù)量相對(duì)較少，分析其原因可能是：（1）樣品本身所含內(nèi)生菌較少；（2）樣品消毒過(guò)于徹底，一些內(nèi)生菌被殺死；（3）培養(yǎng)時(shí)，由于內(nèi)生菌的生存環(huán)境發(fā)生了變化從而影響生長(zhǎng)或生存；（4）存在一些不可分離的內(nèi)生菌[14-15]。

2.2 內(nèi)生菌鑒定

2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的菌落形態(tài)

對(duì)純化后的菌落進(jìn)行形態(tài)觀察并記錄其表面形態(tài)、邊緣形態(tài)、是否隆起、顏色、透明度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果Table 1 Results of colony morphology observation

根據(jù)表1中對(duì)菌落形態(tài)的觀察，初步判斷從哈密瓜中分離所得的菌株均為細(xì)菌。

2.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果

對(duì)21株內(nèi)生菌進(jìn)行革蘭氏染色并使用顯微鏡在油鏡條件下（1000倍）觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分出內(nèi)生菌都為桿菌，革蘭氏顏色反應(yīng)都為紫色，說(shuō)明這些內(nèi)生菌皆為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.2.3 菌株的16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)分離出的哈密瓜內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行DNA提取及16SrDNA基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)測(cè)序，從NCBI核苷酸庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取得到同源性＞99%對(duì)比結(jié)果（當(dāng)相似性＞98%可視為一個(gè)種），結(jié)果見(jiàn)表2，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10]，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 內(nèi)生菌的PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of endophytic bacteria

圖2 鄰接法構(gòu)建的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences using neighbor-joining method

表2 內(nèi)生菌對(duì)比結(jié)果Table 2 Comparison results of endophytic bacteria

由表2可知，結(jié)合形態(tài)和分子鑒定，確定從哈密瓜中分離的21株內(nèi)生菌皆為細(xì)菌，且均為芽孢桿菌，其中解淀粉芽孢桿菌3株，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌2株，多粘類芽孢桿菌2株，蠟狀芽孢桿菌1株，特基拉芽孢桿菌2株，枯草芽孢桿菌最多，為11株，占總菌數(shù)的52.4%。

由圖2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，從哈密瓜中分離的內(nèi)生菌21株均為芽孢桿菌，同屬于厚壁菌門，芽孢桿菌綱，芽孢桿菌目。其中P2、P3為類芽孢桿菌屬，其余19株均為芽孢桿菌屬，占總數(shù)的95%。從而為哈密瓜的加工、儲(chǔ)藏等提供了有利的參考價(jià)值。并且為內(nèi)生菌與宿主之間的關(guān)系及應(yīng)用提供了一定借鑒。

3 結(jié)論

從哈密瓜各組織部位分離到內(nèi)生菌21株，其中從皮中分離出5株，淺層肉中分離出4株，深層肉分離出4株，瓜瓤中分離出2株，籽中分離出6株。其中籽中分離的最多，占總菌數(shù)的28.6%。

經(jīng)鑒定，確定哈密瓜內(nèi)生菌分離出21株細(xì)菌，且均為芽孢桿菌，同屬于厚壁菌門，芽孢桿菌綱，芽孢桿菌目。其中淀粉芽孢桿菌3株，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌2株，多粘類芽孢桿菌2株，蠟狀芽孢桿菌1株，特基拉芽孢桿菌2株，枯草芽孢桿菌最多，為11株，占總菌數(shù)的52.4%。

雖然從哈密瓜中只分離出了21株細(xì)菌，數(shù)量及種類有限，但是在一定程度上反映哈密瓜內(nèi)生菌生物多樣性。

[1]FIORE S D,GALLO M D.Endophytic bacteria their possible role in the host plant[M].Berlin:Springer,1995.

[2]鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2001，43（9）：881-892.

[3]周曉坤.水菖蒲內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性的研究[D].鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)碩士論文，2010.

[4]姜 怡，楊 穎，李文均，等.植物內(nèi)生菌資源[J].微生物學(xué)通報(bào)，2005，32（6）：146-147.

[5]廖新福，劉曼雙.新疆哈密瓜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].新疆農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：1-2.

[6]藍(lán)江林，朱育菁，蘇明星，等.水葫蘆內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（6）：2423-2429.

[7]王玉霞，張淑梅，趙曉宇，等.大豆內(nèi)生細(xì)菌的篩選和鑒定[J].大豆科技，2009（4）：50-51.

[8]劉杰鳳，韓寒冰，張進(jìn)鳳，等.茄類內(nèi)生菌的分離及拮抗細(xì)菌的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：1160-1162.

[9]張志東，謝玉清，楚 敏，等.山藥內(nèi)生菌的分離及菌種鑒定研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（1）：126-129.

[10]周 紅，倪永清，史學(xué)偉.食品微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書[M].石河子：石河子大學(xué)食品學(xué)院，2012.

[11]李雁津.駿棗內(nèi)生細(xì)菌的分離、鑒定與拮抗菌的篩選[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2012.

[12]邱服斌，李雁津，張曉霞，等.人參內(nèi)生細(xì)菌ge21菌株的鑒定及仰菌活性測(cè)定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（1）：43-47.

[13]白飛榮，劉 洋，曹艷花，等.西沙野生諾尼葉片內(nèi)生菌的分離與初步鑒定[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（1）：32-37.

[14]王 春，王 芊，曹 旭.大豆內(nèi)生菌的分離及菌核病拮抗菌的篩選[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（4）：27-29.

[15]崔艷莉，蔣 雪，祁付云，等.釀酒葡萄中內(nèi)生酵母菌的分離與初步鑒定[J].中國(guó)釀造，2012，31（9）：82-84.