骨縫牽引成骨動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用

李東 黃曉翔 Sean Shih-Yao Liu 徐海淞 曹德君 柴崗 韋敏

縫牽引成骨是從口腔正畸技術(shù)發(fā)展起來的，近年來逐漸應(yīng)用于顱頜面外科[1-3]，為面部骨骼發(fā)育不全的治療提供了新的選擇。骨縫牽引成骨是指應(yīng)用外力作用于生長中的骨縫，誘導(dǎo)骨縫及其周邊骨骼改建，使新骨形成、骨骼位置改變的生物過程。目前有關(guān)縫牽引成骨技術(shù)的一些基礎(chǔ)理論和臨床治療問題還有待不斷研究和探討，骨縫牽引成骨較長的療程以及新骨生成、礦化不良所引起的各種并發(fā)癥是影響該技術(shù)在臨床推廣應(yīng)用的主要障礙。

為了進(jìn)一步研究骨縫牽引成骨的機(jī)制及促進(jìn)骨縫牽引成骨效率的方法，我們希望能建立一種既能簡單有效地牽開骨縫，又可調(diào)節(jié)牽引力及牽引方式，且有較高成功率的骨縫牽引動(dòng)物模型。鎳鈦合金彈簧能提供均勻持久的彈性牽引力[4]，結(jié)合新型的即刻牽引微型牽引種植釘（Miniscrew implants，MSI）作為支抗[5-6]，或許能有效牽開骨縫且能控制和調(diào)節(jié)牽引力；而新西蘭白兔的顱骨矢狀縫常被作為顱骨縫實(shí)驗(yàn)的首選。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙⑼蔑B骨矢狀縫牽引成骨的動(dòng)物模型，并驗(yàn)證該模型的可操作性及可靠性，探索局部應(yīng)用rhBMP-2對牽引成骨的作用，為后續(xù)顱縫牽引成骨的相關(guān)機(jī)制研究提供良好的動(dòng)物模型。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔14只，11周齡，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 牽引器

自行設(shè)計(jì)，50 g鎳鈦合金牽開彈簧（Sentalloy GAC，Bohemia，美國），微型牽引種植釘支抗（Daegu，韓國）， 直徑 0.7 mm鈦絲 （99.9%鈦，A Johnson Matthey Company，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

將14只兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（牽引+rhBMP-2，n=7）和對照組（單純牽引，n=7）。兩組分別以50 g力鎳鈦合金彈簧持續(xù)等張牽引29 d；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在顱骨矢狀縫局部應(yīng)用rhBMP-2。

1.3.2 牽引模型的建立及基本操作

以氯胺酮75 mg/Kg肌肉注射麻醉動(dòng)物，手術(shù)區(qū)域備皮，無菌操作。以MSI作支抗植入顱骨固定（圖1A），并分離骨膜，將可吸收海綿（Absorbable collagen sponge，ACS）剪成 6 mm×8 mm×2 mm 大小，浸于濃度為0.1 mg/mL的rhBMP-2溶液中，隨后將浸有rhBMP-2的可吸收海綿置于實(shí)驗(yàn)組骨膜下 （圖1C）。兩MSI之間置入50 g力鎳鈦合金牽開彈簧（圖1D、E）。在MSI前方3~4 mm處，分別釘入2個(gè)鈦釘（圖1F）作為骨影像學(xué)標(biāo)記。對照組動(dòng)物僅行牽引操作，骨膜下未放置rhBMP-2（圖1B）。通過記錄各階段X線片上金屬物影像變化，比較骨縫牽開距離及牽引種植釘偏移情況。在手術(shù)當(dāng)天（0 d）及術(shù)后第5、11、17、23及29 d記錄和調(diào)節(jié)牽引力，并使彈簧始終保持在有效牽引力范圍。

1.3.3 數(shù)據(jù)采集和記錄

第 0、5、11、17、23 及 29 d 記錄動(dòng)物體質(zhì)量，拍攝X線平片及Micro-CT。第7、27天注射四環(huán)素（13.6 mg/lb/im），第 17 天注射鈣黃綠素（10 mg/Kg/im）。前期研究表明，熒光骨標(biāo)記過的動(dòng)物在牽引成骨后，新生骨結(jié)合有熒光骨標(biāo)記，因此可以通過熒光顯微鏡觀察不同時(shí)期矢狀縫間骨骼的改建情況。

1.3.4 組織標(biāo)本的制備

牽引第29天，取有效標(biāo)本區(qū)，包括：矢狀縫，臨近的顱骨，微型牽引種植釘及鈦骨標(biāo)記區(qū)域。并立即用70%乙醇固定7 d。標(biāo)本以甲基丙烯酸甲酯固定后制作成約60 μm的顱縫冠狀面切片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 數(shù)據(jù)的測量與分析

使用Viewbox 3.1軟件，由單人隨機(jī)測量全部X線平片，包括微型牽引種植釘間距MSIr及鈦骨標(biāo)間距MSIm，每張照片測量3次取均值。通過X線平片測量MSIr、MSIm結(jié)果，以評估顱縫牽開情況及牽引種植釘位移情況。

組織切片用Nikon 80i熒光顯微鏡觀察四環(huán)素標(biāo)記（綠色）及鈣黃綠素標(biāo)記（紅色），并用Photometrics Coolsnap K4高清攝像頭及MetaMorph 6.3軟件捕捉影像。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、骨縫牽開距離的比較分別采用t檢驗(yàn)及方差分析，所得數(shù)據(jù)以s表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)前后動(dòng)物平均增重1 093~1 218 g，各組間體重增加差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明牽引治療對兔生長無明顯影響，實(shí)驗(yàn)兔耐受治療。對照組有2只動(dòng)物出現(xiàn)MSI脫落，這些動(dòng)物測量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)截止至MSI脫落前一天。而實(shí)驗(yàn)組未見牽引釘脫落。本次實(shí)驗(yàn)MSI牽引系統(tǒng)成功率為86%（12/14）。

2.2 X線平片及Micro-CT

牽引結(jié)束后行頭顱X線平片測量，并對動(dòng)物頭顱進(jìn)行Micro-CT掃描以評價(jià)牽引效果。

X線平片測量鈦骨標(biāo)記間距變化顯示，牽引周期 29 d 后，對照組顱縫平均牽開（1.28±0.13）mm，實(shí)驗(yàn)組平均牽開（1.04±0.12）mm，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2A、圖 4A）。

X線平片測量牽引種植釘間距MSIr變化顯示，實(shí)驗(yàn)后對照組平均牽開（2.35±0.17）mm，實(shí)驗(yàn)組平均牽開（1.87±0.12）mm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2B、圖 4B）。

相同牽引力及牽引時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組牽引后顱縫間隙較小，說明牽引過程中伴隨有新骨的形成。Micro-CT圖示可明確顯示牽引情況（圖3）。

2.3 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組各熒光免疫標(biāo)記線重疊或間隔狹小 （圖5A），說明在牽引過程中伴隨著較多的快速成骨。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，單純牽引組各時(shí)間點(diǎn)熒光標(biāo)記線清晰（圖5B），說明第7～17天及第 17～27天均有一定量的新骨沿骨縫邊緣向骨縫間隙生長。

圖1 兔矢狀縫牽引模型Fig.1 The rabbit model of sagittal suture traction

圖2 牽引結(jié)束后頭影X線片F(xiàn)ig.2 X-ray after ditraction

圖3 Micro-CT顯示牽引效果Fig.3 The effect of distraction

圖5 矢狀縫冠切面熒光標(biāo)記影像Fig.5 Fluorescent labeled sections of sagittal suture

3 討論

上世紀(jì)60年代以來，隨著上頜骨前移或后退牽引矯正牙頜面畸形的興起，相繼報(bào)道了腭中縫、上頜骨周圍骨縫及顱骨矢狀縫對張力作用的反應(yīng)[7-10]。1997年，Carls等[11-12]報(bào)道了通過骨縫牽引成骨延長了6只成年狗的硬腭，驗(yàn)證了顱面部骨縫牽引成骨的可行性；1999年，Tung等[13]通過牽引兔顱縫成骨實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了縫牽引成骨的可行性。柳春明等[14]在狗模型上，經(jīng)手術(shù)形成硬腭的裂隙，用鎳鈦記憶合金縫牽引器牽張腭骨外側(cè)縫，使裂隙兩側(cè)腭骨向中線移動(dòng)關(guān)閉裂隙成功，說明縫牽引技術(shù)可以誘導(dǎo)犬腭骨外側(cè)縫的骨再生，修復(fù)硬腭的缺損。以上動(dòng)物模型雖然能進(jìn)行縫牽引成骨的相關(guān)研究，但是狗、羊等大型動(dòng)物模型不易大量飼養(yǎng)，牽引器的設(shè)計(jì)及制造也相對復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本較高，缺乏大樣本實(shí)驗(yàn)的可行性。

本實(shí)驗(yàn)中，我們成功創(chuàng)建了以微型牽引種植釘MSI為支抗的兔顱骨矢狀縫牽引系統(tǒng)。經(jīng)驗(yàn)證，該顱縫牽引模型操作簡單，牽引方式可控，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)所有牽引裝置均耐受治療全過程，無銹蝕、彎曲及斷裂現(xiàn)象。在器械外露端，皮膚與器械緊密貼合，封閉性良好，軟組織均一期愈合，未見感染發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中所用的11周齡新西蘭白兔為青壯年期[15]，可見只要骨縫未閉合，仍可通過牽引應(yīng)力對骨縫進(jìn)行改建，達(dá)到矯正顱面部骨骼畸形的目的。

本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用了微型牽引種植釘MSI作為即刻牽引支抗，雖然螺紋長度只有3 mm，但是成功率達(dá)到了86%，和以往文獻(xiàn)報(bào)道的術(shù)后種植釘即刻牽引成功率接近[16-18]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，大多的種植釘牽引失敗多在前1~2周[19-22]，這可能是由于首次種植后，種植釘與顱骨結(jié)合穩(wěn)定度不夠造成的。我們總結(jié)了各牽引釘脫落的可能原因，認(rèn)為第一對微型牽引種植釘脫落可能是因操作不當(dāng)及螺釘磨損導(dǎo)致，種植釘螺紋的損傷極易導(dǎo)致種植牽引的失敗[22]；另一對微型牽引種植釘在第18天脫落，未見明顯感染跡象，可能是由于種植后牽引種植釘周圍骨質(zhì)愈合不好加上牽引中輕微的移動(dòng)，導(dǎo)致脫落。而實(shí)驗(yàn)組則未見牽引種植釘?shù)拿撀洌紤]主要與其在牽引過程中的快速成骨有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中3 mm微型牽引種植釘較常用的種植牽引支抗要短，我們較高的成功率說明，對于種植釘?shù)姆€(wěn)定性，其直徑的大小較之長度更為重要[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力刺激作用于顱面部骨縫，影響其中的成骨細(xì)胞的增殖分化和基質(zhì)合成，使骨縫的寬度增加，骨縫邊緣新骨沉積[24-25]。在外牽引力的作用下，骨縫的組織與形態(tài)發(fā)生明顯的變化：骨縫變寬；骨縫組織中的細(xì)胞發(fā)生分化、增殖，新骨不斷形成。骨縫組織為適應(yīng)外牽引力而發(fā)生了一系列的骨縫組織結(jié)構(gòu)的改建，從而形成了新的骨縫組織形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，牽引后對照組骨縫標(biāo)本頭影平片及Micro-CT精細(xì)三維重建均可見矢狀縫牽開距離較大，可見明顯骨縫間隙，有一定量的新骨沿應(yīng)力方向排列。說明牽引成骨模型成功建立，并且牽引過程中伴隨新骨形成。

BMP參與骨骼的生長、發(fā)育及創(chuàng)傷修復(fù)，rhBMP-2的臨床應(yīng)用基于其生物學(xué)活性。Wang等[26]最早發(fā)現(xiàn)利用大鼠的脫鈣骨基質(zhì)作為載體，rhBMP-2可以誘導(dǎo)骨形成。研究顯示，rhBMP-2誘導(dǎo)新骨形成的同時(shí)，可與原來存在的骨成功結(jié)合，這顯示了rhBMP-2臨床應(yīng)用的可能性。近年來，相關(guān)研究關(guān)注于BMP在牽張成骨過程中的作用[27-28]。為了探討rhBMP-2是否能加速牽引成骨，本實(shí)驗(yàn)我們在單純牽引的基礎(chǔ)上，局部應(yīng)用rhBMP2進(jìn)一步觀察其對顱縫的改建作用。

通過測量牽引種植釘及鈦骨標(biāo)在牽引前后的位移，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組骨縫在0~5 d牽開趨勢與對照組相似，但5~29 d骨縫牽開率較對照組明顯下降。各組骨縫牽開數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析顯示，對照組與實(shí)驗(yàn)組矢狀縫牽開距離之差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。我們認(rèn)為，在牽引早期由于周圍組織的彈性阻力及成骨量較少，所以牽引距離增加較快；而在5 d后，周圍組織的彈性阻力及臨近骨組織的阻力作用開始顯現(xiàn)，所以牽引距離的增加速度開始下降，尤其是實(shí)驗(yàn)組，局部應(yīng)用rhBMP-2導(dǎo)致局部快速成骨，使得牽引阻力進(jìn)一步增加，最終導(dǎo)致其牽開距離明顯小于對照組。經(jīng)組織學(xué)切片觀察骨縫冠切面顯示，對照組骨縫間隙明顯，各時(shí)間段熒光標(biāo)記線清晰顯示，說明在各時(shí)間段均有一定量的新骨生成，但新骨生成量不及牽開的速度。而在實(shí)驗(yàn)組，熒光標(biāo)記線多數(shù)重疊或狹窄，骨縫可見有較多的骨質(zhì)形成。說明在牽引過程中，伴有快速成骨，局部應(yīng)用rhBMP-2能明顯促進(jìn)牽引成骨的速度。因此，局部應(yīng)用適當(dāng)濃度的rhBMP-2可提高縫牽引成骨效率，縮短牽引治療周期，并有可能減少術(shù)后復(fù)發(fā)。

兩組牽引結(jié)束后，MSI的牽開距離稍大于鈦骨標(biāo)之間的距離，但差別均小于2 mm，我們認(rèn)為這種距離差異主要與周圍軟組織的彈性阻力，以及鄰近骨組織的阻力有關(guān)。這說明，在牽引阻力明顯增加后，MSI在牽引力作用下相對骨面產(chǎn)生了微小位移。文獻(xiàn)報(bào)道指出，即刻種植牽引可使種植釘偏移達(dá)2 mm以上[29]，本實(shí)驗(yàn)持續(xù)牽引位移在可接受范圍內(nèi)。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用自行研制的微型種植釘彈力牽引系統(tǒng)，成功地建立了兔矢狀縫彈力牽引成骨模型，該模型證實(shí)矢狀縫牽引成骨效果可靠，具有可行性、可靠性、可重復(fù)性、價(jià)格便宜、成功率較高的特點(diǎn)。在骨縫牽引過程中，局部應(yīng)用rhBMP-2可提高縫牽引成骨效率，縮短牽引治療周期，減少術(shù)后復(fù)發(fā)。

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