皮膚擴(kuò)張急性期miRNA表達(dá)譜的變化及關(guān)鍵miRNA的篩選

劉文輝 黃曉璐 李海洲 余慶雄 梁筱 周怡雯 李青峰

皮膚擴(kuò)張急性期miRNA表達(dá)譜的變化及關(guān)鍵miRNA的篩選

劉文輝 黃曉璐 李海洲 余慶雄 梁筱 周怡雯 李青峰

目的明確擴(kuò)張急性期miRNA表達(dá)譜的變化，篩選出其中的關(guān)鍵miRNA。方法建立大鼠皮膚擴(kuò)張模型，在擴(kuò)張急性期取材，以未擴(kuò)張皮膚為對(duì)照，利用miRNA芯片檢測(cè)miRNA表達(dá)譜的變化，并利用t檢驗(yàn)和差異表達(dá)的倍數(shù)變化，篩選出關(guān)鍵miRNA。利用TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)關(guān)鍵miRNA的靶點(diǎn)，并通過(guò)KEEG和IPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析，以探究關(guān)鍵miRNA調(diào)控皮膚擴(kuò)張急性期的可能機(jī)制。結(jié)果本研究篩選出11個(gè)關(guān)鍵miRNA，這些關(guān)鍵miRNA調(diào)控多個(gè)與增殖分化、血管化、纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路。結(jié)論本研究篩選出皮膚擴(kuò)張急性期的11個(gè)關(guān)鍵miRNA，調(diào)控?cái)U(kuò)張過(guò)程中多個(gè)重要通路的變化，可以作為調(diào)控皮膚擴(kuò)張的靶點(diǎn)。

皮膚擴(kuò)張小分子核糖核酸通路分析

皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)是整復(fù)外科的重要手段。然而常規(guī)擴(kuò)張?zhí)峁┑钠つw有限，不能滿足大面積缺損修復(fù)的需要。因此，促進(jìn)皮膚的再生能力，提高擴(kuò)張效率，一直是整復(fù)外科的研究熱點(diǎn)之一。目前，有研究認(rèn)為罌粟堿[1-2]、雌三醇[3]、A型肉毒毒素[4]、二甲亞砜[5]、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[6]、鈣通道阻滯劑[7]和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[8]等能夠提高擴(kuò)張效率，但由于毒副作用、維持時(shí)間、給藥途徑等因素，而使其應(yīng)用受到限制。臨床上尚缺乏能有效促進(jìn)皮膚再生并提高擴(kuò)張效率的方法。盡管已從組織和細(xì)胞水平上詳細(xì)了解了擴(kuò)張過(guò)程中機(jī)體的各種變化，但基因水平上尚缺乏系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)，不能明確擴(kuò)張過(guò)程中的關(guān)鍵分子，并針對(duì)這些關(guān)鍵分子實(shí)行有效的干預(yù)。

microRNA（miRNA）是體內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)非編碼RNA。盡管哺乳動(dòng)物中編碼miRNA的基因僅占整個(gè)基因組的1%～5%，卻可能調(diào)控著超過(guò)1/3的人類基因[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)上千種miRNA，調(diào)控分化、增殖、凋亡等生理過(guò)程[10]，miRNA的組織/細(xì)胞特異性表達(dá)、靶向調(diào)節(jié)和給藥方式多樣等特性使其成為理想的疾病診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)[11-12]。然而，擴(kuò)張過(guò)程中miRNA的變化尚未見(jiàn)報(bào)道，明確這些變化將有助于加深對(duì)擴(kuò)張過(guò)程中各種變化的理解，從而為提高擴(kuò)張效率提供新的思路。

在皮膚擴(kuò)張的不同階段，隨著炎癥、血流動(dòng)力學(xué)和生物力學(xué)等因素的變化，細(xì)胞的生理狀態(tài)也在發(fā)生著變化。研究證實(shí)，擴(kuò)張急性期中，機(jī)械張力能較快開(kāi)啟增殖相關(guān)通路[13-16]，細(xì)胞的增殖能力也會(huì)迅速增強(qiáng)，然后逐漸恢復(fù)正常[17-18]。這種變化趨勢(shì)表明，擴(kuò)張急性期有可能包含皮膚再生的關(guān)鍵變化，因此有必要對(duì)擴(kuò)張急性期的各種變化加以明確。本研究的目的是明確擴(kuò)張急性期中miRNA的變化，找出其中的關(guān)鍵miRNA，并對(duì)其功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

雄性SD大鼠（我院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），7～8周齡；20 mL皮膚軟組織擴(kuò)張器（廣州萬(wàn)和整形材料有限公司）；RNA提取試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）；miRNA芯片采用Affymetrix microRNA 3.0基因芯片平臺(tái)（上海伯豪生物技術(shù)有限公司）。

1.2 建立擴(kuò)張模型

將3只SD大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，背側(cè)皮膚備皮。麻醉后，在大鼠頸部后方作3 cm切口，切開(kāi)皮膚、皮下至深筋膜淺層。然后向頭側(cè)及尾側(cè)剝離形成腔隙。其中尾側(cè)剝離范圍為3 cm×6 cm。向頭側(cè)腔隙中放置擴(kuò)張器注射壺，并將擴(kuò)張器植入尾側(cè)剝離腔隙，術(shù)畢，縫合切口。術(shù)后1周待切口愈合后，向擴(kuò)張器內(nèi)注入40 mL無(wú)菌生理鹽水。

1.3 RNA提取

注水2 h后，麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，背部皮膚備皮，標(biāo)記擴(kuò)張皮膚中心區(qū)域（約2 cm×2 cm），快速抽走擴(kuò)張器內(nèi)無(wú)菌生理鹽水，捏起擴(kuò)張皮膚，在標(biāo)記區(qū)域附近作切口，迅速剪下標(biāo)記區(qū)域皮膚，另在背部未擴(kuò)張區(qū)域剪下相同大小的皮膚作為對(duì)照。將取下的皮膚在冰上勻漿，并用總RNA提取試劑盒提取皮膚標(biāo)本中的RNA。

1.4 miRNA芯片

將RNA樣本提交給上海伯豪生物技術(shù)有限公司，委托其進(jìn)行miRNA芯片的雜交、數(shù)據(jù)讀取和正態(tài)化工作。

1.5 差異miRNA篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

對(duì)擴(kuò)張與未擴(kuò)張皮膚的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)，P＜0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)的miRNA，并計(jì)算其在擴(kuò)張與未擴(kuò)張皮膚中差異表達(dá)的倍數(shù)變化。差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到1.5倍的即為關(guān)鍵miRNA。然后利用TargetScan（www.targetscan.org）和miRDB（mirdb.org/miRDB）數(shù)據(jù)庫(kù)，分別對(duì)篩選出的關(guān)鍵miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，取兩者的交集作為預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行下一步分析。

1.6 miRNA靶點(diǎn)的通路分析

對(duì)預(yù)測(cè)出的miRNA靶點(diǎn)，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEEG）數(shù)據(jù)庫(kù)和Ingenuity Pathway Analysis（IPA，www.ingenuity.com）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析，明確這些靶點(diǎn)所涉及的生理功能和通路。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA

擴(kuò)張與未擴(kuò)張皮膚差異表達(dá)的miRNA共有41個(gè)，其中表達(dá)倍數(shù)變化超過(guò)1.5倍的有11個(gè)（表1）。

2.2 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

對(duì)篩選出的miRNA進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)（表1），除rno-miR-184和rno-miR-702-5p外，其余關(guān)鍵miRNA預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)較多，提示其調(diào)節(jié)的細(xì)胞功能較廣泛。

2.3 miRNA靶點(diǎn)的通路分析

利用KEEG數(shù)據(jù)庫(kù)和IPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析。KEEG（圖1A）的結(jié)果表明，篩選出的11個(gè)miRNA調(diào)控了Wnt和MAPK等通路。IPA（圖1B）的分析結(jié)果表明，11個(gè)miRNA參與了FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路的調(diào)節(jié)。

圖1 miRNA靶點(diǎn)的通路分析結(jié)果Fig.1 Pathway analysis results of miRNA targets

表1 皮膚擴(kuò)張前后差異表達(dá)的miRNATable 1 Differentially expressed miRNAs after skin expansion

3 討論

本研究首次明確了皮膚擴(kuò)張急性期miRNA表達(dá)譜的變化，從中篩選出了11個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)變化較大的miRNA，并通過(guò)這對(duì)些關(guān)鍵miRNA調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確了這些miRNA可能調(diào)節(jié)的生理功能。

通路分析的結(jié)果表明，11個(gè)miRNA參與調(diào)控了Wnt、MAPK、FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路，這些通路在細(xì)胞增殖分化、血管化、纖維化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中都起到了重要的作用，表明這11個(gè)miRNA通過(guò)對(duì)其靶點(diǎn)的調(diào)控，能廣泛地影響皮膚的再生能力。因此，這11個(gè)皮膚急性擴(kuò)張期的關(guān)鍵miRNA可作為未來(lái)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)靶點(diǎn)。

Dharap等[19]發(fā)現(xiàn)，在大腦的缺血預(yù)處理模型中，miR-485、miR-331和miR-21都有顯著的差異表達(dá)，說(shuō)明這3個(gè)miRNA在組織的缺血適應(yīng)中起到了一定的作用。Redova等[20]同樣證實(shí)了miR-21在缺氧狀態(tài)下的差異表達(dá)。而本研究也發(fā)現(xiàn)這3個(gè)miRNA有著顯著的差異表達(dá)。因擴(kuò)張過(guò)程中皮膚處于相對(duì)缺血缺氧的狀態(tài)，因此這3個(gè)miRNA可能參與了皮膚對(duì)這種相對(duì)缺血缺氧狀態(tài)的適應(yīng)過(guò)程。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵miRNAs調(diào)控了VEGF通路的功能，這有可能是皮膚適應(yīng)相對(duì)缺血狀態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制之一。

Liu等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-21與TGF-β1相互調(diào)節(jié)，并且兩者間存在正反饋?zhàn)饔茫籅ronnum等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-21具有調(diào)節(jié)EMT的作用，這和本研究通路分析的結(jié)果是一致的。由于TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和多種炎癥細(xì)胞存在廣泛的作用[23]，而EMT在多種纖維化疾病中也具有重要的作用[24-25]，因此miR-21可能通過(guò)對(duì)TGF-β和EMT的調(diào)控對(duì)皮膚擴(kuò)張進(jìn)行調(diào)節(jié)。另外，Gabriely等[26]認(rèn)為，miR-21具有調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）的作用，而MMPs參與了NF-κB[27]、ERK[28]和EMT[25，29]等通路的調(diào)節(jié)，并且在膠原沉積和組織重塑中發(fā)揮著重要作用[30]。因此，MMPs是也可能是miR-21調(diào)控皮膚擴(kuò)張的重要中間分子之一。

本研究尚存在一定的局限。由于皮膚擴(kuò)張是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，在擴(kuò)張的不同階段，隨著炎癥、血流動(dòng)力學(xué)和生物力學(xué)等因素的變化，細(xì)胞的生理狀態(tài)存在著不同的變化。因此，要明確擴(kuò)張過(guò)程中的各種變化，需要一系列時(shí)間序列的基因芯片數(shù)據(jù)，未來(lái)的研究將會(huì)著力于完善相關(guān)數(shù)據(jù)，明確擴(kuò)張過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的變化，并追蹤本研究發(fā)現(xiàn)的11個(gè)關(guān)鍵miRNA的變化趨勢(shì)，從而進(jìn)一步明確11個(gè)關(guān)鍵miRNA調(diào)控皮膚擴(kuò)張的機(jī)制。

本研究首次明確了皮膚擴(kuò)張急性期miRNA表達(dá)譜的變化，有助于在基因水平上加深我們對(duì)擴(kuò)張過(guò)程中各種變化的理解。本研究同時(shí)篩選出了11個(gè)關(guān)鍵miRNA，并利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)它們調(diào)控多個(gè)影響皮膚再生能力的重要通路。因此，這11個(gè)關(guān)鍵miRNA可作為調(diào)控皮膚擴(kuò)張的靶點(diǎn)，指導(dǎo)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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miRNA Expression and Key miRNA Screening in Acute Stage of Skin Expansion

LIU Wenhui,HUANG Xiaolu,LI Haizhou,YU Qingxiong,LIANG Xiao,ZHOU Yiwen,LI Qingfeng.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn).

Objective To determine the miRNA expression and screen key miRNA in acute stage of skin expansion. Methods Skin expansion model was established and skin samples were harvested in acute stage.Unexpanded skin was also harvested as control.miRNA microarray was undertaken to reveal the miRNA expression change during acute expansion process.T test and fold change of differential expression were applied to screen key miRNAs.TargetScan and miRDB were used to predict target genes of key miRNA.Pathway analysis was performed for target genes by KEEG and IPA.Results Eleven key miRNAs were detected which regulate pathways involve cell proliferation,differentiation,vascularization,fibrosis and tumorigenesis.Conclusion Eleven key miRNAs determined in the present study regulate important pathways in acute stage of skin expansion and they could serve as targets in skin expansion.

Skin expansion;MicroRNA;Pathway analysis

R622

A

1673－0364（2015）01－0010－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.01.003

2015年1月10日；

2015年1月30日）

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81230042）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。