金黃色葡萄球菌腸毒素的快速檢測(cè)

魏曉敏（黑龍江省勃利縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，黑龍江勃利154500）

?

金黃色葡萄球菌腸毒素的快速檢測(cè)

魏曉敏
（黑龍江省勃利縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，黑龍江勃利154500）

摘要：金黃色葡萄球菌中的毒素型菌株常會(huì)引起人中毒，且多發(fā)于氣溫較高的季節(jié)，易被污染的食物有肉餡、涼粉、剩飯、米酒、蛋及蛋制品等。常采用免疫學(xué)方法檢測(cè)葡萄球菌腸毒素，該方法不僅敏感、特異，而且簡(jiǎn)便快速。其中反向乳膠凝集、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和膠體金法3種方法較為實(shí)用，常用于金黃色葡萄球菌腸毒素的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；腸毒素；快速檢測(cè)

金黃色葡萄球菌中的毒素型菌株常會(huì)引起人中毒，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，多發(fā)于氣溫較高的季節(jié)，易被污染的食物有：加少量淀粉的肉餡、涼粉、剩飯、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷飲（如棒冰等）、含乳糕點(diǎn)等。金黃色葡萄球菌的致病力主要取決于其產(chǎn)腸毒素和凝固酶的能力，其產(chǎn)生的腸毒素可沾染食物，食者吃下約100ng的腸毒素即可出現(xiàn)食物中毒癥狀，主要是嘔吐和腹瀉。腸毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破壞，常采用免疫學(xué)方法檢測(cè)葡萄球菌腸毒素，不僅敏感、特異，且簡(jiǎn)便快速，其中反向乳膠凝集和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)兩種方法較為實(shí)用。

1　膠體金法

1.1適用范圍

肉餡、涼粉、剩飯、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷飲（如棒冰等）、含乳糕點(diǎn)等食物易感染金葡菌。

1.2檢測(cè)原理

采用雙抗體夾心法，把抗金葡菌腸毒素特異性抗體包被在硝酸纖維素膜上，用于捕捉標(biāo)本中的腸毒素，再用特異性抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針進(jìn)行檢測(cè)。

1.3操作步驟

第一，樣品處理。一是固態(tài)食品：稱(chēng)取樣品約2g，充分剪碎。加5mL生理鹽水振蕩10min，使內(nèi)容物充分浸入。自然沉降或離心后取上清液作為樣品檢測(cè)液。二是液態(tài)食品：吸取0.1mL，加生理鹽水0.4mL，混勻后作為樣品檢測(cè)液。第二，測(cè)定。取試劑一個(gè)，撕開(kāi)外包裝，吸取樣品檢測(cè)液，滴加3～4滴（約0.2mL）于試劑圓孔中，2min后開(kāi)始觀察結(jié)果，10min終止觀察。

1.4結(jié)果判定

第一，陽(yáng)性結(jié)果。試劑窗口“C”和“T”（對(duì)照和檢測(cè)）處出現(xiàn)2條紅色沉淀線為陽(yáng)性，即有肉毒毒素檢出。第二，陰性結(jié)果。試劑窗口“C”（對(duì)照）處出現(xiàn)1條紅色沉淀線為陰性，即無(wú)肉毒毒素檢出。第三，試劑失效。試劑窗口“C”和“T”（對(duì)照和檢測(cè)）均無(wú)紅色沉淀線，即試劑失效。

2　反向乳膠凝集法

2.1適用范圍

反向乳膠凝集法適用于各種固體、液態(tài)易感染金葡菌的食品，肉餡、涼粉、剩飯、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷飲（如棒冰等）、含乳糕點(diǎn)等。

2.2檢測(cè)原理

金黃色葡萄球菌腸毒素免疫的抗體血清經(jīng)過(guò)純化后與聚苯乙烯乳膠顆粒結(jié)合，這些乳膠顆粒與相應(yīng)的腸毒素相互結(jié)合，就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的凝集反應(yīng)。

2.3主要試劑

V型微孔板/10孔驗(yàn)血片，生理鹽水，聚苯乙烯乳膠。

2.4操作步驟

第一，樣品處理。稱(chēng)取樣品約2g，充分粉碎，加5mL生理鹽水振蕩10min，使內(nèi)容物充分浸出，自然沉降或離心5min，3 000r/min，取上清液作為樣品檢測(cè)液。第二，測(cè)定。取1L潔凈板1塊，滴加待檢樣品0.10mL，再滴加高免血清致敏乳膠0.01mL，以牙簽或火柴桿混勻，在3min內(nèi)判定結(jié)果。

2.5結(jié)果判定

如果有金葡菌腸毒素存在，會(huì)出現(xiàn)凝集反應(yīng)，形成特定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終在微孔底部擴(kuò)散形成一層沉淀。若不存在腸毒素或低于檢測(cè)限，就不會(huì)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，乳膠顆粒就會(huì)緊密地凝集在微孔底部。

2.6注意事項(xiàng)

第一，同時(shí)提供陰性質(zhì)控，即與未經(jīng)免疫的血清結(jié)合的乳膠顆粒。第二，食品的抽提物或菌落濾渡在5排V型微孔板中進(jìn)行稀釋?zhuān)梢詸z測(cè)肉毒毒素最低檢測(cè)限。

3　ELISA方法

3.1適用范圍

ELISA方法適用于乳制品、巧克力、熏肉、魚(yú)肉、生肉、熟豬肉、海產(chǎn)品。

3.2檢測(cè)原理

將已知金葡菌腸毒素抗體包被于固態(tài)載體微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品（含有抗原）提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)后，在微孔板表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，加入酶標(biāo)記抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)樣品中的抗原量。反應(yīng)載體是微孔板中包被針對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素的特異性抗體。

3.3儀器與試劑

第一，器材。96孔微孔板，勻漿機(jī)或攪拌器，離心機(jī)≥3 000～3 500r/min，磁力攪拌器，pH計(jì)或pH試紙，渦旋振蕩器，移液器100～1 000μL，計(jì)數(shù)板，0.2μm過(guò)濾器，透析袋，酶標(biāo)儀。

第二，試劑。ELISA試劑盒。生肉提取試劑盒（將每個(gè)試劑瓶加入400μL蒸餾水，分裝成20μL/瓶。儲(chǔ)存在-30℃～-15℃條件下）。提取緩沖液（可選），Na2HPO4·2H2O35.6g或KH2PO46.8g，溶解于1 000mL水中。pH調(diào)試劑，NaOH（6mmol/L），HCl（6mmol/L）。聚乙二醇（MW>17 000），將30g聚乙二醇溶解于100mL蒸餾水中，輕微加熱。陽(yáng)性質(zhì)控稀釋液按照1∶50的比例用蒸餾水稀釋陽(yáng)性質(zhì)控（40μL陽(yáng)性質(zhì)控加2mL蒸餾水），混合均勻。稀釋洗滌緩沖液按照1∶20的比例用蒸餾水稀釋洗滌緩沖液。混合并加至洗滌設(shè)備。發(fā)色劑和底物混合液將50μL發(fā)色劑和50μL底物混合。

3.4操作步驟

第一，固態(tài)食品。把25g食物樣品加入25mL提取緩沖液中，用混合器混合均勻，若過(guò)于黏稠，加入提取緩沖液或蒸餾水。將懸濁液室溫下（18℃～25℃）放置30min，便于毒素?cái)U(kuò)散。離心分離（15min，3 000r/min）或過(guò)濾殘?jiān)∩锨逡海{(diào)pH值至7.0～7.5。如果有沉淀，進(jìn)行再次離心分離取上清液，備用。第二，液態(tài)和罐裝菌類(lèi)食品。直接用罐中液體不需要提取，測(cè)定前確保pH值在7.0～7.5。第三，熟豬肉和海產(chǎn)品。采取固態(tài)食品提取步驟，以蒸餾水替代提取緩沖液。第四，生肉。為了防止假陽(yáng)性結(jié)果，要對(duì)生肉另行提取。按照固態(tài)食品一般步驟在室溫下提取。pH值至7.0～7.5，每1mL提取液加入20μL生肉提取液1，均質(zhì)，室溫孵育10min （18～25℃）。再加入20μL生肉提取液2，均質(zhì)，室溫孵育10min，調(diào)pH值至7.0～7.5，過(guò)濾，取濾液備用。

參考文獻(xiàn)：

［1］王世平.食品安全檢測(cè)技術(shù)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2015：92.

［2］師邱毅.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：38.

［3］曾慶祝.食品質(zhì)量與安全檢測(cè)［M］.北京：中國(guó)質(zhì)檢出版社，2015：45.

Rapid Detection of Staphylococcus Aureus Enterotoxin

WEI Xiao-min
(Boli County, Heilongjiang Province Qualityand Technical Supervision, Boli 154500, China)

Abstract:Staphylococcus aureus toxins strain often causes poisoning and mainly occurs in the high temperatures of the season, foods easily contaminated are meat, jelly, leftovers, rice wine, eggs and egg products.Immunological methods are often used to detect staphylococcal enterotoxin, which is sensitive, specific, simple and fast.Wherein the reverse latex agglutination method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method and colloidal gold method are more practical, which are commonly used in rapid detection of staphylococcus aureus enterotoxin.

Key words:Staphylococcus aureus; Enterotoxin; Rapid detection

作者簡(jiǎn)介：魏曉敏（1973-），女，黑龍江勃利人，高級(jí)工程師，主要從事食品檢驗(yàn)工作與研究。

收稿日期：2015-12-25

中圖分類(lèi)號(hào)：R155.3+

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-8646（2016）02-0018-02