體外添加不同水平硝酸鹽對綿羊瘤胃干物質消化率的影響

路佩瑤，曹寧賢，王福傳，宋獻藝，張 凱

（1.山西省農業科學院飼料獸藥研究所，太原 030031；2.山西省畜禽繁育工作站，太原 030001）

反芻動物排放的甲烷是飼料在瘤胃內發酵所產生的，是一種高能物質。甲烷的生成是反芻動物維持其瘤胃微生態平衡的有效機制。甲烷主要在反芻動物瘤胃和后腸道內產生，是甲烷菌利用氫、二氧化碳和乙酸等物質為底物經過酶促反應后的產物。甲烷菌主要游離于瘤胃液或吸附在原蟲表面以及胞液內，其利用纖維分解菌產生的氫等底物合成甲烷，并主要以噯氣的形式排出體外，這對降低瘤胃內的氫分壓起著重要作用，因此甲烷菌與其他微生物緊密聯系共同維持著瘤胃內穩定的微生態內環境的穩定[1]。

研究表明，甲烷所消耗的能量約占飼料可消化能的6%～12%，低質粗飼料可達15%，也就是說反芻動物在消化過程中有20%能量轉化成甲烷浪費掉。瘤胃中甲烷的產生既造成能量損失，又加劇溫室效應，然而其對反芻動物是有益的。如何在降低甲烷生成的同時又不影響動物的健康和生產性能，達到環境和經濟的雙重效益，是目前研究的重點。

研究證明，通過添加硝酸鹽改變電子受體，使電子流向甲烷生成菌之外的微生物，促進硝酸鹽還原菌在瘤胃內的生長發育，使這些還原菌與甲烷生成菌競爭氫原子而達到抑制甲烷產生的目的[2]。但是當瘤胃中硝酸鹽添加過量時，硝酸鹽可被還原生成亞硝酸鹽，有可能引起亞硝酸鹽中毒，而且硝酸鹽本身還是很強的血管收縮劑，另外大量的硝酸鹽會降低反芻動物的采食量[3]。因此，本試驗采用體外產氣量法，研究瘤胃微生物適應硝酸鹽前后，添加不同劑量硝酸鹽對瘤胃干物質消化率的影響，探討是否可以通過逐漸飼喂的方法使瘤胃微生物適應硝酸鹽，且不影響瘤胃對營養物質的消化。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及飼養

試驗動物由山西省農業科學院飼料獸藥研究所養殖基地提供。選用健康的、裝有永久性瘤胃瘺管的晉中羯羊6只為試驗動物。隨機分為2組，對照組綿羊不飼喂硝酸鹽，以尿素加豆粕為氮源，作為研究瘤胃微生物未適應硝酸鹽時的瘤胃液供體動物。試驗組綿羊用KNO3逐漸代替尿素氮，直到KNO3的喂量達到日糧干物質的2.27%，待動物適應硝酸鹽1周后，作為研究瘤胃微生物適應硝酸鹽時的瘤胃液供體動物。

1.2 試驗基礎日糧

試驗基礎日糧精粗飼料比例為30∶70，精飼料為混合精飼料，粗飼料為羊草。每天7:00和19:00飼喂兩次，基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平

1.3 活體外人工瘤胃產氣量試驗

活體外人工瘤胃產氣量試驗參照Menke等建立的體外產氣法進行[4]。該法測得的200mg飼料干物質24 h產氣量與綿羊活體內有機物質消化率之間具有高度正相關[5]。試驗底物以可溶性淀粉和纖維素為碳源，添加量分別為0.16和0.24 g；以KNO3作為唯一氮源，添加量分別為0.0032、0.0064和0.0134 g（NO3-N的含量分別為0.25%、0.50%和2.0%），將不同添加量的KNO3均勻地混入400mg底物中，每個處理3個重復，并設3個空白對照。晨飼前分別采集A組和B組瘤胃內容物，分別用4層紗布過濾，過濾后的瘤胃液與緩沖液配制為1∶2的混合培養液。將60 mL混合培養液加入到預熱的盛有底物的培養瓶中39℃培養。

1.3.1 體外培養緩沖液的配制

試驗所用緩沖液按照Russell和Jeraci方法配制[6]。

微量元素溶液（A）：每100 mL蒸餾水中含Ca?Cl2·2H2O 13.2 g、MnCl2· 4H2O 10 g、CoCl· 6H2O 1.0 g、FeCl3· 6H2O 8.0 g。

緩沖溶液（B）：將NH4HCO34.0 g和NaHCO335.0 g溶于蒸餾水，最后定容至1000 mL。

常量元素溶液（C）：Na2HPO45.7 g、K2HPO46.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g溶于蒸餾水，最后定容至1000 mL。

刃天青溶液：濃度為0.1%的刃天青溶液（m/V，厭氧指示劑，煮沸后有游離氧存在時呈紅色，無氧時呈無色）。

還原液溶液：NaOH 160mg和Na2S·9H2O 625mg溶于100 mL蒸餾水（使用時臨時配制）。

1.3.2 人工瘤胃營養液的準備

按照上述順序和比例配制瘤胃微生物緩沖液：蒸餾水400 mL+溶液A 0.1 mL+溶液B 200 mL+溶液C 200 mL+刃天青溶液1 mL+還原劑溶液40 mL，加入刃天青溶液后混合液變為紅色，通入無氧CO2并預熱至39℃后約30 min，混合液顏色變淡或無色。在與過濾瘤胃液混合之前加入還原劑并通CO2氣體使溶液褪至完全無色。

1.3.3 人工瘤胃培養液的配制

在晨飼前用導管經瘤胃瘺管真空抽取至少2只羊的瘤胃內容物置于預熱至39℃的保溫瓶中，混合均勻后經4層紗布過濾，量取所需體積（瘤胃液與人工瘤胃營養液的體積比為1∶2）的瘤胃液迅速加入到準備好的人工瘤胃營養液中，制成混合人工瘤胃培養液。混合人工瘤胃培養液邊加熱邊用磁力攪拌器攪拌，同時通入無氧CO2[7]。

1.3.4 加樣和培養

用自動加液器向每個培養瓶中分別加入上述混合培養液60 mL。同時做3個空白（只有培養液而沒有底物）。將培養瓶迅速放入已預熱（39℃）的水浴箱中，待加液完畢后成批轉入人工瘤胃培養箱中培養，搖動1次·h-1[8]。

1.3.5 樣品采集

在體外培養至24 h時，將培養瓶分別取出放入冰水浴中使其發酵停止，洗滌培養管瓶中的殘渣并將其與對應樣品離心所得沉淀一起用蒸餾水懸浮，再離心，重復兩次后在105℃烘干12～24 h，稱重并計算樣品干物質消化率。

1.3.6 統計分析

試驗數據采用SAS（Statistical Analysis System）的ANOVA方法進行統計分析，用Duncan's方法進行顯著性分析，結果以“平均值±標準誤”表示。樣本干物質消化率計算公式見式1。

瘤胃內干物質分解常數以Marquardt的方法為基礎，根據SAS的非線性回歸方式按下列公式測定出a、b、c的值[9]。瘤胃內不同時間的干物質降解率適合方程見式2。

式中，P為t時間營養物質小時率；a為快速降解部分（%）；b為慢速降解部分（%）；c為b的降解常數；t為待測飼料在瘤胃中滯留的時間（h）。

2 試驗結果

瘤胃微生物適應硝酸鹽前后添加不同劑量硝酸鹽對干物質消化率的影響見表2。

表2 瘤胃微生物適應硝酸鹽前后添加不同劑量硝酸鹽對干物質消化率的影響%

由表2可知，瘤胃微生物未適應硝酸鹽時，低NO3組與中NO3組、高NO3組干物質消化率差異顯著（P＜0.05），中NO3組和高NO3組差異不顯著（P＞0.05）。瘤胃微生物已適應硝酸鹽時，低NO3組與中NO3組、高NO3組干物質消化率差異不顯著（P＞0.05），中NO3組和高NO3組差異不顯著（P＞0.05）。瘤胃微生物未適應硝酸鹽時，對照組與低NO3組間差異顯著（P＜0.05），與中NO3組、高NO3組間差異不顯著（P＞0.05）。

瘤胃微生物已適應硝酸鹽時，對照組與中、低NO3組的干物質消化率均差異顯著（P＜0.05），與高NO3組差異極顯著（P＜0.01）。瘤胃微生物未適應硝酸鹽時的低NO3組與已適應硝酸鹽時的低NO3組、中NO3組差異不顯著（P＞0.05），與高NO3組間差異顯著（P＜0.05）。瘤胃微生物未適應硝酸鹽的中NO3組與已適應硝酸鹽的低NO3組、中NO3組差異顯著（P＜0.05），與高NO3組差異極顯著（P＜0.01）。瘤胃微生物已適應硝酸鹽的高NO3組與低NO3組、中NO3組差異顯著（P＜0.05），瘤胃微生物適應硝酸鹽前后的高NO3組間干物質消化率差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

本研究結果表明，對照組的干物質消化率顯著低于瘤胃微生物已適應硝酸鹽時的低、中、高NO3組（P＜0.05）。瘤胃微生物已適應硝酸鹽時，低、中、高NO3組間的干物質消化率差異不顯著（P＞0.05）。出現這種現象的原因是瘤胃微生物已適應硝酸鹽，亞硝酸鹽轉化成氨的速度與硝酸鹽的還原成亞硝酸鹽的速度持平甚至超過，使瘤胃微生物可以利用更多的氮，并且適應后瘤胃微生物利用硝酸鹽的能力大幅加強[10]。而微生物未適應硝酸鹽時，低NO3組的干物質消化率顯著高于對照組、中NO3組和高NO3組（P＜0.05）。出現這種狀況的原因是少量的硝酸鹽進入瘤胃會經瘤胃微生物的作用還原成亞硝酸鹽，并進一步還原成氨，為瘤胃微生物提供氮源，促進其對干物質的消化[9]。

更大劑量的硝酸鹽進入瘤胃時，硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的速度會逐漸加快，甚至超過亞硝酸鹽還原成氨的速度，在此過程中產生的亞硝酸鹽則表現出毒性作用，引起干物質消化率降低[10]。試驗結果證明，可通過逐漸添加硝酸鹽的方法使反芻動物逐步適應硝酸鹽，且不影響干物質消化率。

4 結論

試驗結果表明，硝酸鹽在瘤胃微生物消化干物質的過程中起著重要的作用，能夠促進干物質的消化吸收。

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