26例骨髓增生性腫瘤JAK2基因直接測序分析

梁紹燕 湯麗燕 朱允蘭

【摘要】目的 了解JAK2基因V617F突變在骨髓增生性腫瘤中的發生率。方法 收集骨髓增生性腫瘤共26例。其中PV組8例；ET組12例；CML組4例；PMF組2例。直接測序檢測JAK2基因V617F突變。結果 PV組JAK2V617F陽性率為87.5%（7/8）；ET組陽性率為33.3%（4/12）；PMF組陽性率為50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等惡性血液病患者及正常對照均為陰性。結論 檢測JAK2基因V617F突變可作為一種分子標記對PV進行診斷，并對ET、PMF診斷提供幫助。

[Abstract] Objective To learn the incidence of JAK2 gene V617F mutation in the myeloproliferative disease （MPNs）. Methods Collected MPNs 26 cases with PV 8 cases， ET 12 cases and PMF 2 cases， then tested JAK2 gene V617F by sequences. Results The positive rate of JAK2 gene V617F mutation was 87.5% （7/8） in PV and 33.3%（4/12） in ET and 50%（1/2） in PMF. However all the cases in AML、ALL、CML、CNL、CEL were negative. Conclusion JAK2 V617F mutation test might serve as a gene marker for diagnosis in PV， at the same time help to the diagnosis for ET and PMF.

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2015）03-0001-02

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）是一類起源于多能造血干細胞，以一系或者多系分化相對較成熟的骨髓細胞克隆性增生異常為特點的一組疾病的統稱。增生的細胞其細胞形態和功能相對正常，常表現為多能髓樣造血干細胞所屬的細胞系（包括紅細胞系、血小板系、粒-單核細胞系）中的一系或多系細胞惡性增生。骨髓增生性腫瘤（MPNs）包括真性紅細胞增多癥（PV）、原發性血小板增多癥（ET）、慢性髓細胞樣白血病（CML）和原發性骨髓纖維化（IMF）。研究發現，JAK2 V617F突變發生在PV、ET、特發性骨髓纖維化、骨髓發育不良癥候群、嗜酸細胞過多綜合征、慢性骨髓單核細胞性白血病、慢性中性粒細胞性白血病、系統性肥大細胞增多癥等疾病中。正是由于JAK2基因V617F突變在多種疾病中都有發現，檢測人群該基因突變將會對進一步闡明其引發的廣譜的血液病提供依據。

對于JAK2基因V617F突變進行分子診斷國內外的專家建立了數種方法，包括：直接測序、特異引物等位基因PCR法、酶切法、熒光PCR法等，本文用測序法對MPNs做了檢測。

1.材料與方法

1.1試劑與儀器：Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒購自大連寶生物公司， dNTP，Tag酶購自南京凱基，生物工程技術有限公司，熒光定量PCR儀為羅氏480，凝膠成像分析系統為美國UVP公司Imaging System。

1.2標本來源：收集重慶市兒童醫院骨髓增生性腫瘤共26例。其中PV組8例；ET組12例；CML組4例；PMF組2例。

1.3 標本采集：采集靜脈全血，EDTA-Na2抗凝，4℃保存備用。

1.4 DNA提取：采用大連寶生物Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取DNA，操作按說明書進行，抽提好的DNA樣品經紫外分光光度計檢測1.62

1.5 引物設計及合成

1.5.1 根據Genbank提供的參考序列（Accession number：9944145），利用Primer5.0與Bioedit7.0自行設計引物探針

1.5.2 引物序列

上游引物：5- AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3

下游引物5-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3

1.6 擴增體系及條件

反應體系為50ul，包括10×PCR緩沖液10ul；10umol/L dNTP 1ul；5U/ul Taq酶1ul；模板2ul；10pmol/L上、下引物各1ul；ddH2o 34ul。擴增條件：95℃ 8分鐘預變性。然后94℃ 60秒，54℃ 60秒，72℃ 90秒，共35個循環。最后72℃延伸10分鐘，4℃保存備用。

4.8.4 測序，將7.1制備的擴增產物

2 測序結果

2.1. JAK2V617F突變在惡性血液疾病中的表達情況

PV組JAK2V617F陽性率為87.5%（7/8）；ET組陽性率為33.3%（4/12）；PMF組陽性率為50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等惡性血液病患者及正常對照均為陰性。JAK2V617F基因突變在PV、ET、PMF患者中的陽性率有顯著性差異（X2=47.799，P<0.05）

2.2. 測序結果圖

用bioedit7.0生物軟件顯示1849位堿其G突變為T，且突變位點出現套峰，如圖7所示。

圖5 JAK2基因1849位堿基正常測序圖

3.講論

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）是一類起源于多能造血干細胞，以一系或者多系分化相對較成熟的骨髓細胞克隆性增生異常為特點的一組疾病的統稱[1]。增生的細胞其細胞形態和功能相對正常，常表現為多能髓樣造血干細胞所屬的細胞系（包括紅細胞系、血小板系、粒-單核細胞系）中的一系或多系細胞惡性增生；而細胞形態和功能相對正常。常伴有肝脾腫大等外周器官浸潤。正由于其具有腫瘤性疾病的特征，在2008年新修訂的WHO慢性髓系腫瘤分類中將既往沿用多年的“慢性骨髓增殖性疾病”舊稱更名為“骨髓增殖性腫瘤”。MPNs包括4種經典的MPNs以及非典型的MPNs，前者包括慢性髓性白血病（CML）、真性紅細胞增多癥（PV）、原發性血小板增多癥（ET）和原發性骨髓纖維化（PMF），后者包括慢性中性粒細胞白血病（CNL）、肥大細胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒細胞白血病（CEL）和不能分類的MPNs。

研究發現，90%的PV患者中存在JAK2基因V617F突變，進一步研究闡明了其機理：JAK2基因14號外顯子第1849位核酸上發生點突變（G>T）使得JH2區域的第617位纈氨酸突變為苯丙氨酸（V>F）。正常情況下，JH2區域抑制JAK2激酶活性，發生突變后抑制作用減弱，從而使JAK2激酶活性明顯增強。

迄今為止，臨床主要依靠其臨床表現、血常規、血清EPO水平、NAP積分、骨髓細胞形態或骨髓活檢等進行診斷，而且必須排除繼發性因素，但有時仍難以與有相似癥狀或血象表現的其他疾病相鑒別，例如繼發性紅細胞增多癥，反應性血小板增多，類白血病反應，MDS等，給我們的診斷造成一定的困難，因此對該類疾病找到一種可靠的基因標記將對臨床診斷提供很大的幫助。James[2]首先報道了在PV患者中發現JAK2V617F點突變，其后在MPNs的其他亞型中也陸續發現了該突變的存在，但陽性率高低不一。本實驗研究發現JAK2V617F點突變在PV患者中陽性率最高，其次為PMF、ET患者，在AML、ALL、CML中為陰性，與國際上報道相符[3]。本實驗還發現ET患者中JAK2V617F突變與血紅蛋白量、血小板數量無關。但國外有報道[4][5]ET患者中JAK2V617F點突變陽性者血紅蛋白量較高、血小板計數較低，故我們的實驗還有待增加病例總數以便作進一步分析。PV患者陰性例數較少，未做比較。PV和ET陽性患者白細胞計數顯著高于陰性患者。國外研究亦發現陽性患者中白細胞計數高，且可以作為獨立的危險因素與血栓形成及骨髓纖維化成正相關[6]。

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