正交實驗確定Alcalase水解大豆蛋白的最佳實驗條件＊

孫顯慧

（濰坊職業學院，山東 濰坊 261041）

大豆蛋白質的水解方法可分為酸水解、堿水解和酶水解法等多種方法，由于酸堿水解方法存在許多不足之處，如營養成分損失，水解無特異性，副反應多，水解產物感官性能差，反應條件不易控制等，所以在這方面的研究不是太多。相比而言酶解反應條件溫和，反應易于控制，反應過程中營養物質的破壞較小，因此，從1970年代起，日本和美國的研究學者就開始致力于酶水解生產大豆蛋白水解產物的研究。在我國，從1980年代起也有一些科研人員開始研究大豆多肽的酶解法生產。目前為止，酶法水解大豆蛋白質生產大豆多肽成了研究的一個重要方向，用于研究大豆蛋白水解的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶及微生物蛋白酶等；由于各種不同的酶對蛋白質作用的位點不同，得到的產物也就不同，不同的酶也可能給產品帶來不同的風味，甚至帶來難以除去的苦味。近幾年來，有人用微生物發酵技術制備大豆肽［1］，這種方法將酶的生產和應用合二為一，省去了中間步驟，不需要添加額外的酶就可以生產出大豆肽，大大降低了成本，這種制備技術成了大豆多肽研究的一個新的方向。

本研究利用枯草桿菌蛋白酶Alcalase對大豆分離蛋白進行水解，得到大豆多肽粗溶液。酶的水解過程往往受到水解的底物、溫度、pH值及酶濃度等多種條件的影響。本研究主要通過正交實驗來確定蛋白酶Alcalase對大豆分離蛋白的最佳水解條件。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與主要試劑

大豆分離蛋白粉（蛋白含量91%）（山東濟南冠力科貿公司）；枯草桿菌堿性蛋白酶Alcalase2.4L（粉末狀顆粒，標注酶活力2.4Au／g，濟南百泰生物酶制劑有限公司）；6mol／L HCl溶液（分析純）；5mol／L NaOH溶液（分析純）。

1.2 儀器設備

凱氏定氮裝置（定制）；HH－6數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；精密增力電動攪拌器（常州國華電器有限公司）；酸度計PHS－2型（上海雷磁儀器廠）；721分光光度計（上海第三分析儀器廠）；LXJ－Ⅱ型離心沉淀機（福州醫療器械廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白酶水解工藝

稱取一定量大豆分離蛋白→溶解至一定濃度→90℃預處理→冷卻至酶適宜溫度→用5mol／L的NaOH溶液調酶適pH值→放入以預熱的恒溫水浴鍋→攪拌→加入一定量的酶制劑，并用5mol／L的NaOH溶液保持反應的pH值恒定→反應結束，85℃下滅酶15min→冷卻至50℃以下，用6mol／L的HCl溶液調至pH4.2→離心分離得上清液。

在蛋白酶水解的過程中應嚴格控制水解的溫度、pH值，盡量保持其水解條件恒定，以使酶水解在酶的最佳反應條件下進行。

1.3.2 酶解反應條件的優化

酶水解反應結果受反應溫度、底物、酶濃度、反應pH值及反應時間的影響，為了確定最佳酶解反應條件，首先采用單因素多水平進行實驗，篩選出影響酶反應各因素的最佳條件（另文整理）；根據各因素的最佳條件，列出正交實驗表進行正交實驗，以確定各因素對酶解反應的相互影響作用，最終確定酶解反應的最佳條件。

1.3.3 大豆分離蛋白水解度的測定

大豆分離蛋白酶水解液水解度的測定采用茚三酮顯色法［2］。

標準曲線的制作：取干燥過的甘氨酸0.1g，溶解后定容至100mL，取2.00mL定容至100ml，得20ug／L的溶液。分別稀釋成含量為2－20ug／L系列溶液，同時作空白樣。取2.00mL測定稀釋液于試管，加入1.00mL茚三酮，混勻后置于沸水浴中加熱15min后用冷水冷卻20min加入5.00mL的40%乙醇混勻，放置15分鐘后用1cm比色杯于570nm測吸光值A，并繪制A－C關系曲線。

樣品測定：取0.5mL水解蛋白溶液定容至50mL，取0.4mL稀釋液移入試管中并加入l.6mL蒸餾水，混勻，加入1mL茚三酮顯色劑，混勻后置于沸水浴中加熱15min后用冷水冷卻（同時作空白），加入5.00mL的40%乙醇溶液混合，放置15min后用1cm比色杯以空白管于570nm調零測吸光值A，以此算出－NH2的含量（mmol／L）。

水解度DH計算：

其中，0.33umol／g：原料大豆蛋白中－NH2的含量；7.8umol／g：每克原料大豆蛋白中肽鍵的毫摩爾數。

2 結果與討論

2.1 單因素多水平的研究

物濃度、酶濃度、反應溫度、反應pH值及反應時間等對Alcalase蛋白酶水解反應結果的影響已另文整理，在此省略。

研究發現上述各個因素對反應有著不同程度的影響，但是對反應影響程度的大小不同。但是從各因素對反應的水解度DH及蛋白質回收率的影響基本上呈現相同的趨勢。因此可以取水解度或蛋白質回收率為指標，進行正交實驗，以確定酶水解反應的最適條件。

2.2 正交實驗確定Alcalase蛋白酶水解反應最佳條件

影響酶反應的幾個主要因素為底物濃度、酶濃度、反應溫度、反應pH值及反應時間等，根據以上單因素結果分析，考慮到對生產效率的影響，底物濃度采用8%、反應時間2h，選擇反應溫度、pH值、酶濃度為三個影響因素分別取三個水平，同時以水解反應的蛋白質水解度為指標進行正交實驗，正交因素水平見表見1，正交實驗結果見表2。

表1 L9（33）正交實驗因素水平表

表2 L9（33）正交實驗結果及極差分析表

從以上分析可以得出，各因素對實驗指標（DH）的影響按大小次序來說應該是A（溫度）＞C（酶濃度）＞B（PH），最好方案是：A2C2B2，即溫度60℃，酶濃度（E／S）3.6Au／100g底物，反應PH8.0。

在正交實驗中沒有出現分析出來的最優方案，與它接近的是第4、5號實驗，在第4號實驗中只有PH值不處在最好水平，第5號實驗中酶的濃度不是處于最好水平，但是PH的影響是三因素中最小的，酶濃度對水解度的影響遠遠小于溫度的影響，而且實驗做出的結果中第4、5號實驗結果接近，水解度分別為19.3%和21.0%，是9個平行實驗中的水解度數值最高的兩個。第5號實驗酶的用量增大使水解度增大，取本實驗為最佳實驗會很大程度上提高生產成本。因此選擇溫度T：60℃，酶濃度（E／S）：3.6Au／100g底物，PH8.0為最優實驗方案。

3 結論

利用Alcalase蛋白酶水解大豆分離蛋白，底物濃度采用8%、反應時間2h，選擇反應溫度T、PH值、酶濃度為三個影響因素分別取三個水平，以水解反應的蛋白質水解度為指標進行三因素三水平的正交實驗。通過正交實驗確定了Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白得到大豆多肽溶液的最佳實驗條件：底物濃度8%，酶濃度（E／S）3.6Au／100g底物，溫度60℃，PH8.0。

［1］趙芳芳，張日俊.大豆肽的功能及其在畜牧業中的應用前景［J］.獸藥與飼料添加劑，2003，（8）：17－18.

［2］郭興鳳.蛋白質水解度的測定［J］.中國油脂，2000，25（6）：176－177.