高劑量肺癆康對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的抑制作用*

陳歡 葉品良 張豐華 張傳濤 楊思捷 王帥

“肺癆康”是由百部、白芨、天冬等11味中藥組成，經(jīng)臨床長(zhǎng)期實(shí)踐總結(jié)出的一首經(jīng)驗(yàn)方。前期研究發(fā)現(xiàn)肺癆康可以促進(jìn)肺結(jié)核患者臨床癥狀和肺部體征消失，促進(jìn)肺部病變吸收，痰涂轉(zhuǎn)陰[1]。在體外抗菌試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，肺癆康對(duì)耐利福平結(jié)核桿菌具有抑制作用[2]。在體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高劑量肺癆康（灌胃給藥劑量6 g/kg）對(duì)耐利福平結(jié)核菌具有抑制作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在前期研究基礎(chǔ)之上，觀察高劑量肺癆康對(duì)耐利福平結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的臟器指數(shù)影響及主要臟器病理形態(tài)學(xué)變化，探討高劑量肺癆康對(duì)耐利福平結(jié)核分枝桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 肺癆康：由天冬、沙參、麥冬、阿膠、百部等組成，所需藥品均購(gòu)自同仁堂藥店成都分店，采用常規(guī)方法煎煮后濃縮，制備成每毫升含生藥1 g的藥液，冷藏備用，使用前用生理鹽水稀釋。對(duì)照藥：利福平，由沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H21021905，規(guī)格：0.15 g/膠囊。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 H37RV標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC：27294），由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心臨床分中心提供；單耐利福平（A菌組INH編號(hào)：332，B菌組INH編號(hào)073），由四川省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種小白鼠100只，雌性，SPF級(jí)，體重（20±2）g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所提供，合格證號(hào)為：SCXK（川）2012-24。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 培養(yǎng)箱A2型：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA2：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱CS101-2EBN：重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司恒達(dá)儀器廠；電子恒溫水箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；顯微鏡Bx-43：Olympus；手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)Leitz1516：Leica；全自動(dòng)染色機(jī)Autostainer XL：Leica；全自動(dòng)脫水機(jī)TSJ-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司；病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ：常州市中威電子儀器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物造模 100只雌性小鼠按隨機(jī)原則抽取20只小鼠作為空白對(duì)照組后，余下的小鼠全部以尾靜脈注射0.4 mL濃度為5×104CFU/mL的耐藥結(jié)核菌液造模，穿刺部位壓迫止血1 min。

1.5.2 動(dòng)物分組 造模2周后，進(jìn)行PPD試驗(yàn)，將試驗(yàn)陽(yáng)性小鼠隨機(jī)分為模型組、利福平組、肺癆康組、肺癆康與利福平聯(lián)合組（后簡(jiǎn)稱：聯(lián)合組），共四組，每組20只，分籠飼養(yǎng)，造模小鼠與空白組小鼠隔離飼養(yǎng)。

1.5.3 動(dòng)物給藥 空白對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)菌株組和耐藥菌株組均給予同體積生理鹽水每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。利福平組：給予同體積的利福平每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。肺癆康組：給予同體積的高劑量肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。聯(lián)合組：給予同體積的利福平及肺癆康混懸液（6 g/kg）每日灌胃一次，連續(xù)灌胃56 d。

1.5.4 指標(biāo)測(cè)定 各組小鼠治療前稱取質(zhì)量一次，治療后每周稱取質(zhì)量一次，觀察并記錄各組動(dòng)物的存活時(shí)間，分別于治療8周后處死小鼠，取小鼠全肺和脾臟觀察小鼠每個(gè)臟器的結(jié)核結(jié)節(jié)，臟器的病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色），并研磨、稀釋后接種于改良羅氏雞卵平皿培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)核菌數(shù)。

HE染色法具體方法為：取下新鮮的動(dòng)物組織塊（一般厚度不超過(guò)0.5 cm）投入預(yù)先配好的固定液中（10%中性福爾馬林溶液），使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死后的自溶或細(xì)菌的分解，從而保持細(xì)胞本來(lái)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋，冷卻凝固成塊即成。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，一般為5~8 μm厚度。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干。染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，就可染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料結(jié)果均以（x-±s）表示，組間計(jì)量資料比較采用組間t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化及存活時(shí)間 與空白組比較，模型組動(dòng)物死亡時(shí)體重明顯降低（P<0.05），通過(guò)高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后動(dòng)物死亡時(shí)體重與模型組動(dòng)物死亡時(shí)體重比較，各組動(dòng)物死亡時(shí)體重明顯升高，其中高劑量肺癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白組比較，模型組動(dòng)物平均存活天數(shù)明顯縮短（P<0.05），經(jīng)過(guò)高劑量癆康組（6 g/kg）、聯(lián)合組治療后動(dòng)物存活天數(shù)有所延長(zhǎng)，其中高劑量肺癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 小鼠體重變化及存活時(shí)間比較（x-±s）

2.2 小鼠臟器系數(shù)及肺臟結(jié)核結(jié)點(diǎn)變化 與空白組比較，模型組肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)明顯增加（P<0.05），脾臟系數(shù)降低（P<0.05），通過(guò)高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后可以降低肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，升高脾臟系數(shù)。其中高劑量癆康組、聯(lián)合組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組小鼠肺部均產(chǎn)生肺部結(jié)節(jié)，通過(guò)高劑量癆康組（6 g/kg）、利福平組和聯(lián)合組治療后可以明顯減少肺結(jié)節(jié)的生成，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 小鼠臟器病理組織學(xué)結(jié)果 通過(guò)藥物造模后各組動(dòng)物肝、脾和肺部均發(fā)現(xiàn)炎性改變，采用高劑量肺癆康，利福平和聯(lián)合組治療后可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性病變。見(jiàn)表3。

表2 小鼠臟器系數(shù)及肺臟結(jié)核結(jié)點(diǎn)變化（x-±s）

3 討論

耐藥性肺結(jié)核是指耐一種或一種以上抗結(jié)核藥物的肺結(jié)核，屬于慢性緩發(fā)性傳染性疾病，由于藥物的濫用及結(jié)核桿菌菌種的變異，導(dǎo)致耐多藥結(jié)核病病例不斷增加[4]。據(jù)報(bào)道目前至少有27.8%的肺結(jié)核患者對(duì)現(xiàn)有肺結(jié)核藥物耐藥[5]。目前西藥對(duì)于利福平單耐藥結(jié)核病以利福平、吡嗪酰胺和鏈霉素為核心加用乙胺丁醇，根據(jù)病史及病變嚴(yán)重程度、確定是否加用氟喹諾酮類藥物，至少注射3個(gè)月，總療程不少于9個(gè)月[6]。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道利福平單耐藥結(jié)核病采用標(biāo)準(zhǔn)的治療方案及多種聯(lián)合給藥均可取得較為滿意的臨床效果[7-9]。

表3 小鼠臟器病理組織學(xué)結(jié)果 只

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為耐藥性肺結(jié)核屬于“肺癆”范疇，臨床以咳嗽、咯血、潮熱、盜汗及身體逐漸消瘦為主要特征[10]。目前中醫(yī)藥已成為抗肺結(jié)核的常用藥，其中百部、海浮石、大蒜、黃連、夏枯草、狼毒，貓爪草、苦參能增強(qiáng)感染肺結(jié)核小鼠的免疫力[11-12]，水車(chē)前、貓爪草、苦參具有抑菌作用[13]。中藥復(fù)方保真湯、百部丸、海浮石丸、抗癆保肺丸、保肺丸、地榆稚草湯、月華丸及百合固金湯，與抗結(jié)核西藥聯(lián)合使用可以改善臨床癥狀，減輕抗結(jié)核藥物的毒副作用，降低耐藥率，可以有效應(yīng)用于耐藥性肺結(jié)核的治療[14-23]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量肺癆康、高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合治療后均能升高耐多藥結(jié)核模型小鼠的體重，降低升高的肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，減少肺部結(jié)節(jié)數(shù)，延長(zhǎng)模型小鼠的存活時(shí)間。病理結(jié)果顯示，高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合治療后均可以不同程度緩解肝、脾和肺部炎性改變。對(duì)此筆者認(rèn)為高劑量癆康，高劑量肺癆康與利福平聯(lián)合后可以通過(guò)緩解肝、脾和肺部臟器的炎性反應(yīng)，從而降低肺臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，進(jìn)而說(shuō)明高劑量肺癆康對(duì)耐多藥結(jié)核模型小鼠具有較好的治療作用，但是起具有治療作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

[1]葉品良，盧潤(rùn)生，黃秀深，等.肺癆康治療肺結(jié)核69例[J].江西中醫(yī)藥，2009，40（2）：33.

[2]劉婷婷，葉品良，王帥，等.“肺癆康”對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌抑菌效力的體外研究[J].光明中醫(yī)，2008，2（10）：1453-1454.

[3]王帥，葉品良，申金貴，等.肺癆康對(duì)結(jié)核桿菌體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34（1）：37-38.

[4]葉鶯.耐多藥結(jié)核的流行概況[J].疾病控制雜志，2008，12（1）：63.

[5] Dye C，Scheele S，Dolin P，et al.Consensus statement.Global burden of tuberculosis： estimated incidence，prevalence and mortality by country [J].JAMA，1999，282（7）：677-686.

[6]肖和平.耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南（2010年）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：1-58.

[7]姚嵐，劉一典，張占軍，等.耐藥結(jié)核病化學(xué)治療方案研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（8）：630.

[8]吳斌，朱麗陽(yáng).聯(lián)合應(yīng)用莫西沙星和微卡方案治療耐多藥肺結(jié)核病的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（5）：3-5.

[9]劉曉燕，袁容.γ-干擾素加全身化療治療多耐藥肺結(jié)核的臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（13）：39-40.

[10]周仲瑛.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：108.[11]金偉，王金河，仲斌.大蒜素對(duì)結(jié)核分枝桿菌體外抑菌效果觀察[J].人民軍醫(yī)，2001，44（4）：236-237.

[12]陸軍，葉松，鄧云，等.4種中藥提取物對(duì)塵肺結(jié)核患者感染的耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染小鼠細(xì)胞免疫的影響[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2011，31（10）：893-897.

[13]吳虢東，王玲.抗結(jié)核中藥的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（6）：475.

[14]郭曉燕，張惠勇，鹿振輝，等.中醫(yī)藥治療耐藥肺結(jié)核的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（8）：2028-2029.

[15]劉忠達(dá)，張尊敬，雷永良.中醫(yī)藥治療耐多藥肺結(jié)核病概況[J].浙江中醫(yī)雜志，2011，46（6）：50.

[16]陳祥呈.百部丸治療肺結(jié)核病153例的療效初步報(bào)告[J].中醫(yī)雜志，1959，4（3）：176-178.

[17]趙春甡.復(fù)方“海浮石丸”治療肺結(jié)核空洞15例經(jīng)驗(yàn)介紹[J].山東醫(yī)藥，1960，3（6）：40.

[18]林少麗，林麗芳.五倍子聯(lián)合酸棗仁敷臍治療肺結(jié)核盜汗的療效觀察及護(hù)理[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（11）：141-143.

[19]李超賢，鄧小敏.中西醫(yī)結(jié)合治療難治性肺結(jié)核進(jìn)展[J].中外健康文摘，2011，8（29）：309-310.

[20]董芳，王勝圣，周杰，等.中醫(yī)藥防治肺結(jié)核的優(yōu)勢(shì)及發(fā)展趨勢(shì)[J].中醫(yī)臨床研究，2011，3（12）：113-114.

[21]楊俊梅.中藥對(duì)結(jié)核病的防治作用分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（8）：2081.

[22]郭曉燕，張惠勇，鹿振輝，等.中醫(yī)藥治療耐藥肺結(jié)核的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（8）：2028-2029.

[23]劉忠達(dá)，張尊敬，雷永良.中醫(yī)藥治療耐多藥肺結(jié)核病概況[J].浙江中醫(yī)雜志，2011，46（6）：456-458.