增齡對兔心房及肺靜脈肌袖組織縫隙連接蛋白的影響

李俠 王文革 陳方圓

增齡對兔心房及肺靜脈肌袖組織縫隙連接蛋白的影響

李俠 王文革 陳方圓

目的通過研究家兔心房及肺靜脈肌袖連接蛋白的增齡性改變，探討增齡與房顫的關系。方法以家兔為研究對象，分離不同年齡組家兔心房及肺靜脈肌袖組織，用免疫組化的方法檢測心房及肺靜脈肌袖連接蛋白Cx43和Cx40的表達。結果隨著年齡增加，心房及肺靜脈肌袖組織Cx43的表達量呈明顯的下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論兔心房及肺靜脈肌袖連接蛋白存在增齡性改變，可導致房顫的發生。

增齡；肺靜脈肌袖；連接蛋白；心房顫動

心房顫動（房顫）是一種年齡相關性心律失常，發病率隨年齡的增長而顯著增加，50～59歲組人群中房顫的患病率＜1%，而80～84歲組上升至10%，＞85歲人群為11%～18%［1?2］。隨著年齡的增加，心臟的大體結構及傳導系統發生著相應的變化，心肌組織本身存在著增齡性結構重構和電重構［3］。心房組織特別是其一些特殊結構是否也存在增齡性變化？這些變化有什么規律？有關這些方面的研究，可能對增齡相關的以房顫為主的房性心律失常的發病機制的揭示有著重要的意義。本實驗以家兔為研究對象，分離不同年齡組家兔心房及肺靜脈肌袖組織，檢測縫隙連接蛋白（connexin，Cx）的表達，探討增齡與房顫的關系，為增齡是否是房顫發生的主要或獨立危險因素提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物分組 健康家兔按月齡分為幼齡組（5～10 d）、中齡組（4～6月）、老齡組（30～34月），每組各6只［4］。幼齡、中齡兔購于西安交通大學實驗動物中心，老齡兔購于陜西省閆良種兔場。

1.2 免疫組織化學染色 家兔開胸，分離肺靜脈及左右心房組織。把取得的肺靜脈及左右心房組織塊分別放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋制備石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，室溫3%H2O2處理5 min，以滅活內源性酶，微波修復抗原，滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗，每只家兔取2張心肌切片適當滴加1∶400稀釋的Cx40多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），另2張切片滴加1∶350稀釋的Cx43抗體（武漢博士德試劑公司），置于冰箱中4℃過夜。PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃1 h，PBS緩沖液清洗2 min×3次。滴加鏈霉親和素生物素過氧化物酶復合物（streptavidin biotin complex，SABC）試劑，37℃20 min，PBS清洗5 min×4次。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。每2張切片中的1張再經蘇木素輕度復染，用于觀察Cx40及Cx43的分布。光鏡下Cx40、Cx43陽性著色均表現為棕黃色顆粒。

1.3 圖像分析 每張組織切片上采用OLYMPUS倒置顯微成像系統隨機選擇5個視野，每個視野拍攝5幅照片。用Image?Pro Plus 6.0圖像分析軟件對所采集的圖象進行分析。免疫組化切片測定每個視野下陽性物質的累積光密度（integrated optical density，IOD），對家兔Cx40、Cx43的光密度參數進行半定量分析。

1.4 統計學處理 所有數據均采用均數±標準差（ˉx± s）表示，用SPSS 13.0軟件分析數據。3組均數的比較采用單因素方差分析，若3組之間差異有顯著性，則進行兩兩比較，兩兩比較用LSD?t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

隨著增齡，左、右心房和肺靜脈肌袖組織Cx43的表達量均呈現明顯的下降趨勢（P＜0.05）。見表1。在左、右心房組織內Cx40表達量隨著增齡有明顯減少的趨勢（P＜0.05），但肺靜脈肌袖組織內Cx40表達很弱，變化不明顯，各年齡組間比較無統計學差異。見表2。各組家兔Cx43、Cx40免疫組化染色如圖1～6（封二）所示。

表1 3組家兔心房和肺靜脈肌袖Cx43 IOD比較（ˉx±s，n＝6）

表2 3組家兔心房和肺靜脈肌袖Cx40 IOD比較（ˉx±s，n＝6）

3 討論

心肌細胞間連接處的閏盤中有特化組織，稱之為縫隙連接（gap junction，GJ），GJ允許動作電位從一個細胞擴布到鄰近的另一個細胞，是含有多種細胞間通道的特殊膜結構，由Cx所構成，研究提示Cx的變化可能與一些心律失常有關［5?6］。心房的GJ主要存在于閏盤，是心肌細胞端?端連接的特有結構［7］。研究證實肺靜脈肌袖是人類心臟正常結構的一部分，心肌袖內同樣也有Cx表達［8］。

家兔左、右心房肌均有Cx43和Cx40的表達，同年齡組左、右房Cx43表達量多于Cx40，說明Cx43是心房主要的連接蛋白。肺靜脈肌袖主要表達Cx43，說明Cx43是肺靜脈肌袖主要的連接蛋白；而為何肺靜脈肌袖Cx40的表達極差。既然肺靜脈肌袖組織在解剖上是心房肌的延續，而為何在表達Cx方面存在差異呢？這可能正是局灶性房顫起源于肺靜脈的機制之一，仍需要進行進一步研究。

本研究發現，隨著增齡，心房及肺靜脈心肌細胞中Cx43和Cx40的表達逐漸減少。增齡引起肺靜脈肌袖細胞Cx表達降低，導致細胞間電耦聯性的進一步下降，改變了心肌的電傳導性，使傳導速度減慢或發生傳導阻滯的程度加重，易于形成折返［9?10］。由于折返的波長等于傳導速度與不應期的乘積，增齡引起的Cx重構使傳導速度減慢，從而進一步使折返的波長縮短，易于在緩慢傳導區內形成多個微小折返子波。Cx表達水平越低，相鄰心肌之間的這種傳導性能的差異可能越明顯，這樣就容易形成引起房顫的折返環路。研究表明，房性心律失常都需要解剖基礎上的沖動不連續傳導，其范圍決定心律失常的類型，這種解剖基礎就是Cx表達量和分布上的增齡性變化［11?12］。心房內或者肺靜脈內都可以同時存在多個小的折返環，也可以存在少數幾個大的折返環，當折返環范圍小到一定程度時，單個大折返環在一定程度上變得不穩定，或者分裂成數個小折返環，折返環進一步減小并彌散時，即可導致細顫。

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Effect of aging on connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit

LI Xia．Department of VIP Internal Medi?cine；WANG Wen?ge．Department of Nephrology，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China；CHEN Fang?yuan．Department of Cardiovascular Medicine，Fist Affiliated Hospital of Medical College，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectiveTo investigate the relationship between aging and atrial fibrillation by studying the age?related changes of the expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit.MethodsEighteen healthy rabbits were divided into three groups by age，the chests of the rabbits were opened and the pulmonary vein sleeve were dislodged. The expression of Cx43 and Cx40 were detected by immunohistochemical staining.ResultsThe expression of Cx43 of pulmonary vein sleeve and atrium was statistically decreased with the aging（P＜0.05）.ConclusionsThe expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium presents with age?related changes，which may lead to atrial fibrillation.

aging；pulmonary vein sleeves；connexin；atrial fibrillation

R 541.75

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.01.008

2014?03?24）

730030甘肅省蘭州市，蘭州大學第二醫院VIP內科（李俠）；腎病內科（王文革）；710061陜西省西安市，西安交通大學醫學院第一附屬醫院心血管科（陳方圓）