傳染性單核細胞增多癥患兒細胞免疫功能變化及意義

劉志強，段榮，柯江維

(江西省兒童醫院檢驗科，江西 南昌330006)

傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)是由 EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染引起的淋巴細胞增生性傳染病，小兒時期常見。臨床上以發熱、咽峽炎、淋巴結及肝脾大、外周血中淋巴細胞增加并出現異型淋巴細胞等為特征[1．2]。近年來，隨著臨床免疫學研究的發展，本病免疫功能的改變受到更多的關注。DNT細胞 (CD3+CD4-CD8-T細胞)是新近發現的一類細胞表面既不表達CD4分子同時也不表達CD8分子的T細胞群,它屬于雙陰性調節性T淋巴細胞，對免疫應答有抑制作用，是機體在感染、腫瘤及自身免疫等過程中進行調節的關鍵因素[3]。本文通過檢測IM患兒不同病期外周血DNT細胞與T淋巴細胞分化抗原(CD)的表達水平，并與健康兒童的相應指標作對比分析，觀察IM患兒細胞免疫狀態的變化及可能對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 標本來源 3例IM患兒均為本院血液科2011年9月至2013年7月收治的住院患兒。男36例，女27例。年齡12個月~9歲。均符合IM診斷標準[4]。健康對照組30例，均為同期體檢的健康兒童，男17例，女13例；年齡1~8．5歲。兩組間性別、年齡相比無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 采集IM患兒急性期、恢復期及對照組健康兒童清晨空腹靜脈血lml，置含肝素抗凝管中，標本2h內檢測。

1.2.2 淋巴細胞CD系列表達檢測 取美國BD公司CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE 鼠抗人熒光單克隆抗體混合試劑20ml，加入肝素抗凝血100μl，混勻，室溫避光孵育20min，分別加入紅細胞裂解液1ml，室溫避光放置 10min，1000r/min 離心 5min，棄上清液，用PBS洗滌2次，棄上清，加PBS 250μl上機，采用BD公司FACSCanto流式細胞儀檢測受檢者外周血淋巴細胞CD3+CD4-CD8-淋巴細胞及CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+淋巴細胞的百分率,采用BD FACSDiva軟件進行結果分析。

1.3 統計學處理采用SPSSl3.0軟件處理，數據以表示，組間均數比較采用配對和成組設計t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

急性期IM患兒DNT細胞、CD3+T細胞、CD3+CD4-CD8+T細胞百分比顯著高于恢復期IM患兒和對照組兒童 (P<0.01)，CD3+CD4+CD8-T細胞百分比顯著低于恢復期IM患兒和對照組兒童 (P<0.01)。恢復期IM患兒DNT細胞、CD3+T細胞、CD3+CD4-CD8+T細胞、CD3+CD4+CD8-T細胞百分比與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 IM患兒與對照組DNT細胞及T淋巴細胞亞群水平測定值(s，%)

表1 IM患兒與對照組DNT細胞及T淋巴細胞亞群水平測定值(s，%)

組別 n CD3+ CD3+CD4+CD8- CD3+CD4-CD8+ DNT急性期恢復期對照組63 63 30 85.22±4.31 68.96±1.41 66.89±8.23 20.76±5.13 51.24±4.38 52.64±6.25 62.14±8.21 37.66±5.21 35.42±6.28 10.17±4.16 6.09±1.82 5.64±1.61

3 討論

IM是兒童原發性EBV感染的典型表現，有關研究發現EBV對機體免疫功能的影響可能在IM的發病過程中起著重要作用[5]。典型的IM約80%是CD3+CD4-CD8+細胞毒性T細胞(CTL)擴增活化，它們有良好的溶細胞能力，不僅能識別并殺死EBV感染的B細胞，抑制其分化增殖，還能通過釋放過量細胞因子導致IM癥狀[6]。所以IM患兒的癥狀不是病毒復制直接引起，而是T淋巴細胞免疫反應的結果。亦有研究顯示T細胞激活程度和IM臨床癥狀嚴重程度有一定關聯[7]。因此監測IM患兒細胞免疫功能的改變、掌握正常免疫個體T細胞亞群變化的規律有重要的臨床意義。

本實驗測定了IM患兒不同時期外周血淋巴細胞 CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+的表達，結果顯示：急性期CD3+、CD3+CD4-CD8+T細胞百分比明顯增高，CD3+CD4+CD8-T細胞百分比明顯降低，與林珊[8]報道一致。恢復期CD3+CD4+CD8-T細胞百分比升高、CD3+CD4-CD8+T細胞百分比降低，但與健康兒童無顯著性差異 (P>0.05)，CD3+T細胞百分比與健康兒童比較無顯著性差異 (P>0.05)，與金海榮等[9]的報道不相一致，是否因樣本因素或其它因素有待進一步的觀察。

在急性EBV感染后，大量EBV特異性CD3+CD4-CD8+T細胞增殖，它們有很強的細胞毒作用功能，能殺滅感染的B細胞，并消除病毒[10]。而CD3+CD4+CD8-T細胞在細胞免疫過程中起到免疫輔助作用，同時也具備殺傷功能，在維持EBV感染后細胞免疫反應與被感染細胞清除的平衡中起到一定的作用[11]。本文中IM患兒急性期與對照組健康兒童比較CD3+CD4+CD8-T明顯下降，CD3+CD4-CD8+T明顯升高，而且CD3+CD4-CD8+T急性期與恢復期比較明顯升高且有顯著性差異(P<0.05)。分析原因由于IM患兒急性期CD3+CD4-CD8+T淋巴細胞大量擴增以控制EBV誘導B淋巴細胞增殖，而CD3+CD4+CD8-T淋巴細胞在輔助此過程中被消耗。

以往研究發現，在外周DNT細胞中存在去甲基化的CD8基因[12]，對DNT細胞基因高保守序列進行多個基因位點分析，得出DNT細胞的前體細胞可能是CD8+T細胞[13]，以上研究暗示DNT細胞可能來源于CD3+CD4-CD8+T細胞。體外研究表明，人類DNT細胞在體外被激活后可產生TNF-α，IFN-γ，而不分泌IL-4[14]；從轉基因小鼠中純化出的DNT細胞可通過抑制同系基因型CD4+T細胞或CD8+T細胞來發揮其免疫抑制功能[15]。而Kyttaris等[16]用IL-23R處理取自 MRL/lpr小鼠淋巴結的淋巴細胞可誘導出DNT細胞，此DNT細胞亦高表達IL-17，向淋巴細胞缺陷小鼠輸注此DNT細胞后可導致小鼠狼瘡樣腎炎發生。本研究發現急性期IM患兒DNT細胞是增多的，推測其可能因為EBV的感染，導致大量EBV特異性CD3+CD4-CD8+T細胞增殖，進而促進DNT細胞大量增殖，協同促進炎癥反應的加重。但對于IM患兒DNT細胞確切的作用及機理目前還不清楚。

總之，IM是T細胞功能紊亂性疾病，檢測外周血DNT細胞與T細胞亞群變化對評估患兒的細胞免疫功能狀況，判斷病情預后具有十分重要的臨床意義，同時，針對IM患者細胞免疫功能紊亂的狀態，在原治療的基礎上進行細胞免疫調節治療，一定程度上可促進病情恢復，有效改善預后。

[1]Souza TA,Stollar BD,Sullivan JL,et al.Influence of EBV on the Peripheral Blood Memory B Cell Compartmentl[J].J Immunol,2007,179(5):3153-3160．

[2]PaulGA.Recentadvance in the understanding ofinfectious mononucleosis:are prospects improved for treatment or control?[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2006,4(6):1039-1049．

[3]Thomson CW,Lee BP,Zhang L.Double-negative regulatory T cells:non-conventional regulators[J].Immunol Res,2006,35 (I-2):163.178．

[4]胡亞美,江載芳,諸福棠.實用兒科學[M].第 7版.北京:人民衛生出版社,2003,821-827.

[5]葉中綠,龐偉君,黃秀蘭.EB病毒感染患兒細胞因子水平與T細胞亞群檢測的臨床意義 [J].現代預防醫學,2008,35(12):2306-2308．

[6]Williams H,Crawford D.Epsteion-Barr virus:the impact of scientific advances on clinical practice[J].Blood,2006,107(3):862-869.

[7]胡晨曼,孫梅.EB病毒感染及其免疫反應[J].國際兒科學雜志.2010,37(1):33-35．

[8]林珊.十種血液病患兒外周血T淋巴細胞亞群檢測及臨床意義[J].實驗與檢驗醫學,2009,27(2):133-134.

[9]金海榮,馬名方,蔡云祥.小兒傳染性單核細胞增多癥淋巴細胞亞群動態觀察及臨床意義[J].浙江實用醫學，2010，15(6):453-454.

[10]Margaret L.Gulley and Weihua Tang Laboratary Assays for Epstein-Barr Virus-Related Disease [J].J Molecular Diagnostics,2008,10(4):279-292．

[11]姚瑤,謝正德,申昆玲,等.原發性EB病毒感染后特異性T細胞免疫功能的研究進展[J].國際兒科學雜志,2010,37(1):30-32．

[12]Landolfi MM,Van Houten N,Russell JQ,et al.CD2-CD4-CD8-lymphnode T lymphocytes in MRL lpr/lpr mice are derived from a CD2+CD4+CD8+thymic precursor[J].Immunol，1993,151:1086-1096．

[13]Han M,Harrison L,Kehn P,et al.Invariant or highly conserved TCRa are expressed on double-negative(CD3+CD4-CD8-)and CD8+T cells[J].J Immunol，1999，1631:301-311．

[14]陳炯,杜敏,楊兵,等.DNT細胞分離鑒定及其在正常人外周血中含量的檢測[J]．國際外科學雜志,2009,36(3):154-157．

[15]Yonezawa A,Onaka T,Imada K,et a1.Cytomegalovims-associated infectious mononu-cleosis like syndrome accompanied by transient Monoclonal expansion of CD8+T-cells[J]．Rinsho Ketsueki,2009,50(8):652-657．

[16]Kyttaris VC，Zhang Z，Kuchroo VK，et al．Cutting edge:IL-23 receptor deficiency prevents the development of lupus nephritis in C57BL/6-lpr/lpr mice[J].Immunol，2010,184:4605-4609．