濾紙片低溫冷凍法保存微生物菌株的臨床應用

曹美林，李佳，鄧慧，殷網虎

(鎮江市中醫院檢驗科，江蘇 鎮江212003)

菌種保存方法眾多，選取建立一種保存期長、占用空間小，簡便易行的保存方法，使菌種的生命以及生物學特征得到有效延續是廣大醫學工作者探討的重要課題[1，2]。我院微生物實驗室采用濾紙低溫冷凍法保存臨床菌株，取得了較好的效果，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌種 金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，菌株均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 臨床菌株 觀察對象為本室臨床分離菌株，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌等。

1.1.3 菌株保存管 取新華定性濾紙，剪成大小約15mm×3.5mm，放入1.5ml帶蓋塑料離心管內，每管1~2片，將離心管編號，用離心管盒裝載，121℃滅菌30min后備用[3]。

1.1.4 培養基和儀器 營養瓊脂、SS培養基、哥倫比亞血平板、麥康凱培養基等培養基由上海科瑪嘉微生物技術有限公司生產；珠海迪爾細菌鑒定系統及配套的細菌鑒定條；三洋Biomedical Freezer低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 保存方法 將室內質控菌種在血瓊脂培養基上分離純化，用消毒鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取，每片盡可能刮取較多的菌苔。放于帶蓋塑料離心管內，蓋上蓋子，每菌36管，寫上菌名，置于低溫冰箱的-20℃冷凍保存。對于臨床日常分離出的陽性菌株，先分純目的菌，完成鑒定藥敏操作，然后用消毒小鉗子鉗上濾紙片留取部分剩余菌種，于-20℃冷凍保存，并詳細填寫保存登記本。

1.2.2 檢測方法 質控菌株：每月取出一支保存管，每周一用無菌鑷子夾出菌種紙片，在哥倫比亞血平板上輕輕涂抹，37℃培養復蘇。剩余紙片仍放回離心管內，迅速放冰箱冷藏保存。按照室內質控要求，每周用復蘇菌種做藥敏質控，同時做生化鑒定，觀察菌株生化特性。臨床菌株：根據保存時間的長短，按照保存期 6、12、18、24 個月，每個時間段分別隨機從本室保存菌庫內抽取目標菌株復蘇，檢測細菌的存活情況，并觀察菌落性狀、菌體形態，檢測有關生化指標，比較各菌株的生物學特性是否發生變化。包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌，數量均為3株。

2 結果

2.1 保存期內3株標準菌株變異情況 2011年11月起本室采用濾紙法保存的銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)3株標準菌株，定期按照本室的方法進行復蘇使用，至2013年12月底，菌種存活率均為100%。銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球(ATCC29213)在存活期內，細菌形態、染色特性、生化反應等均無明顯變化，藥敏質控結果非常穩定，說明菌株未發生變異。詳細藥敏質控結果見表1。

表1 3株標準菌株保存2年期間藥敏MIC試驗結果與參照結果對比(μg/ml)

2.2 7種常見菌株的存活情況 在采用濾紙法保存 的臨床菌株庫中，從保存期分別為6、12、18、24個月的菌株中，隨機抽取銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白念珠菌各3株。接種哥倫比亞血平皿和沙保羅瓊脂斜面培養基，經35℃培養18~24h，每個保存期抽取的21株菌存活率均為100%，菌落形態特征無明顯改變且生長良好。詳細結果見表2。

表2 不同保存期7種臨床常見菌的存活情況

2.3 本室臨床菌株保存情況 自2011年11月份本室采用濾紙法保存菌種以來，至2013年12月31日已保存菌株1300株。臨床分離菌株主要以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌等為主。詳細保存情況見表3。

表3 本室細菌庫中分離占前10位的菌種情況

3 討論

為了微生物檢驗的質控工作[4]，進行菌株的分子生物學特征和耐藥性變遷進行監測，以及科研教學[5]等方面的需要，長期保存菌株已成為臨床微生物實驗室的重要工作。菌株的保存方法較多，有明膠片法[5]、磁珠保存法[6]、半固體法[7]、濾紙石蠟法[8]、濾紙法[9]、甘油-生理鹽水法[10]等等，在諸多菌種保存方法中，真空冷凍干燥法效果最佳，但由于設備要求高，制備程序繁雜、占用空間大等缺點，只適用于保存小批量菌種，如乳酸菌的保存等[11]，并不適合臨床大批量的菌種保存[12]。

我們采用濾紙法保存的菌種，通過2年對非苛養菌的觀察，保存的菌株性狀穩定，未發現菌種變異、死亡現象。由于我院檢出的苛養菌數量較少，未進行保存性能觀察。但相關文獻多提示[9]，用濾紙法保存的苛養菌時間較短，效果不是十分理想。楊旭等用濾紙法將流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌保存一年后，存活率分別是6/10、7/10，存在一定數量的菌種死亡現象[13]。而龐璐等以中藥茨實、山藥作為保養液，用濾紙法保存甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌 、肺炎鏈球菌2年，菌種未發生死亡，提示濾紙法配合中藥可以提高苛養菌保存周期[14]。

有作者[14]將濾紙條單獨包裝消毒，保存時臨時從包裝內取出，這樣做的缺點是多了一道環節，增加了污染的可能性，所以我們根據文獻[15]對方法進行了改良，省去這一環節，直接將濾紙條放入離心管內，然后進行消毒滅菌，應用幾年來未發現菌株污染的情況。

我們的應用體會是，純化菌株做完鑒定和藥敏，一定要在當日保存菌種，如果保存不及時，細菌老齡化，一方面容易發生變異，另一方面菌株容易死亡。至于質控菌株，根據經驗，可以在購進時，將菌種分離培養，用濾紙法分裝3~5年的用量，這樣可以保證實驗室每次使用的都是一代菌，從我們的使用情況來看，效果非常滿意。

綜上所述，濾紙片低溫冷凍法保存菌種材料簡單、經濟，操作方便、占用空間小，能避免因反復傳代而引起的菌種變異，是適合臨床實驗室大批量保存非苛養菌的一個好方法。

[1]楊應虹,羅有福,李子成.抗耐藥金黃色葡萄球菌新藥的研究進展[J].華西藥學雜志,2010,25(4):494-496.

[2]陸貞玉.食品中金黃色葡萄球菌及其檢測方法現況[J].預防醫學情報雜志,2010,26(11):892-894.

[3]干迪郁,任利珍,朱立軍.兩種不同的細菌菌種保存方法比較[J].中國鄉村醫藥雜志,2010,17(1O):49-50.

[4]帥麗華,胡志堅,孫曉紅,等.臨床微生物檢驗質量保證和持續改進[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(5):456-458.

[5]王紅,何曉冬,王典高.明膠片菌種保藏法的應用[J].現代預防醫學,2010,37(16):3138-3139.

[6]陳曉 燕,林光.微生物實驗菌種保存方式探討[J].臨床合理用藥,2014,7(10):129-130.

[7]彭俊華,薛榮利,張媛媛,等.三種常用方法保存臨床常見菌種的比較[J].甘肅科學學報,2012,24(3):88-89.

[8]文德學,王興林,胡忠惠,等.濾紙石蠟油法保存淋球菌初探[J].現代醫藥衛生，2013,29(5):698-699.

[9]文德學,顧雪梅,王興林等.菌種濾紙保存法的應用[J].檢驗醫學與臨床,2013,10(11):1486-1487.

[10]彭孝斌.甘油-生理鹽水保存菌種方法介紹[J].預防醫學情報雜志,2014,30(11):933-935.

[11]Fonseca F,Cenard S,Passot S.Freeze-drying of lactic acid bacteria.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),2015,1257:477-88.

[12]白毓謙.微生物實驗技術[M].濟南:山東大學出版社,1986:403.

[13]楊旭,劉曉莉,吳防,等.兩種簡便保存菌種的方法比較[J].檢驗醫學與臨床,2008,5(20):1219-1220.

[14]龐璐,蘇盛通,陳惠業,等.用中藥肉湯保存菌種的研究[J].中外健康文摘,2012,9(36):382-383.

[15]劉金鳳.藥品檢驗常用菌種的保存注意要點[J].中國實用醫藥,2014,9(l1):270-271.