耐復方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌耐藥基因檢測及同源性分析

伍啟康，吳奎海，崔東嵐

(佛山市第一人民醫院檢驗科，廣東 佛山528000)

嗜麥芽窄食單胞菌是一種廣泛存在于自然界和醫院環境的條件致病菌，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，以及侵入性治療技術的不斷應用，該菌已成為院內感染的重要病原菌之一，在非發酵菌的分離率中僅次于鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌[1]，復方新諾明是臨床抗嗜麥芽窄食單胞菌感染的首選用藥，但近幾年，臨床經常能分離到耐復方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌，其耐藥性常和I類整合子中的sul1基因[2]以及ISCR2攜帶的sul2相關[3]。本文主要對耐復方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌株相關基因進行檢測，并對其進行基因分型。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 我院2013年1月至2013年12月共分離獲得126株嗜麥芽窄食單胞菌，其中對復方新諾明耐藥的有22株，剔除同一患者相同部位7d內的重復分離株。

1.2 細菌鑒定和藥敏試驗 法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact儀器及其配套GN鑒定卡進行菌種鑒定，藥敏試驗采用K-B法。依據臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2013年標準判斷結果，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌A TCC27853。

1.3 主要儀器和試劑 德國Eppendorf公司的PCR擴增儀器，Bio-Rad公司的凝膠儀,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細菌基因組DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產品。復方新諾明藥敏紙片購自英國OXOID公司，

1.4 PCR擴增 DNA的提取參考試劑盒說明書，-40℃保存。相關基因的PCR反應體系均為20μl體積,其中含 Mg2+的 10×buffer 2μl，dNTP 200μmol/L，上下游引物 0.2μmol/L，DNA 模板 1μl，TaqDNA 聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20μl。所擴增的sul1、sul2、ISCR1、ISCR2 陽性菌株均為本實驗 PCR擴增陽性并測序驗證，具體的引物序列和退火溫度見表1。

表1 PCR反應的引物序列

圖1 部分耐復方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌ERIC-PCR電泳結果

1.5 PCR產物序列分析 sul1和整合子I陽性產物送華大基因科技公司進行純化并雙向測序，利用DNAstar軟件對測序結果進行序列校正，在Gen-Bank中用Blastn進行核酸同源性搜索，分析基因類型。

1.6 ERIC-PCR 對耐復方新諾明的嗜麥芽窄食單胞菌進行基因分型，分析其遺傳相關性。引物ERIC-2:AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG[6]。反應條件為 95℃預變性 5min；94℃變性 1 min，26℃退火 2min，72℃延 伸 1min，4 個 循 環 ；94℃變 性 1 min，40℃退火 1min，72℃延伸 1min，40 個循環；72℃延伸 10min。

2 結果

2.1 藥敏試驗 復方新諾明的耐藥率為17.4%(22/126)，中介為4.0%(5/126)，敏感率為 78.6%(99/126)。

2.2 PCR擴增 在126株嗜麥芽窄食單胞菌中，sul2和ISCR2均陰性。在22株耐復方新諾明菌株中，15株I類整合子基因盒和sul1均為陽性，有1株僅sul1陽性。在104株復方新諾明中介或敏感菌株中，sul1和I類整合子基因盒檢測均為陰性。

2.3 I類整合子基因盒 15株I類整合子基因盒測序結果：dfrA17,aadA5同時陽性9株，aacA4、blaIMP-25、blaOXA-30、catB3 同 時 陽 性 1 株 ，aadB、aadA2同時陽性 1株，dfrA15陽性 4株，qacF陽性1株。

2.4 ERIC-PCR 電泳條帶集中分布在250～3000bp之間，分21個基因型，部分結果見圖1。

3 討論

整合子因其在細菌耐藥基因水平轉移中的重要作用而受到研究者的關注，I類整合子在臨床上最常見，結構由3個部分組成:5’保守末端(5’conserved segment,5’CS)、 3’ 保守末端(3’conserved segment,3’CS)和兩者之間的可變區(variable region)。3’CS包括3個開放讀碼框(ORF)：磺胺耐藥基因 (sul1)，季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因 (qacE△1)及功能不明的ORF5[7]。可變區帶有不同數量的基因盒，大部分是編碼各種抗生素抗性的耐藥基因盒。本研究結果表明，耐復方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶率較高，達到68%(15/22)。從基因盒攜帶的耐藥基因來看，包括耐甲氧芐啶類 (dfrA17，dfrA15)、耐氨基糖苷類(aadA5，aacA4，aadB ，aadA2)、耐氯霉素(catB3)、β-類酰胺酶類(blaIMP-25，blaOXA-30)、耐消毒劑(qacF)。 Huang 等[8]通過基因敲除的方法，發現I類整合子能明顯增加復方新諾明的耐藥性，但消毒劑的MIC濃度未見明顯改變，可能是qacF基因產生的耐藥作用較小，主要與菌體外膜通透性有關。嗜麥芽窄食單胞菌I類整合子攜帶的氨基糖苷類耐藥基因可以增加氨基糖類的MIC濃度，但其染色體攜帶的Aph(3’)-IIc、aac(6′)-Ib′、SmeZ 、SmeJK 可導致高水平氨基糖類耐藥[9,10]。ISCR2屬于插入序列一種，通過滾換復制轉移鄰近序列，是一個強有力的移動系統，攜帶多重耐藥編碼基因[11,12]，如SXT、質粒介導的氯霉素和磺胺類藥物耐藥，常與sul2基因相關。在126菌株中未檢出基因ISCR2、sul2，可能是由于地區和菌種差異，sul2在歐洲、南美地區或腸桿菌科細菌的檢出率相對較高[3]。在6株耐復方新諾明菌株中，4種耐藥基因均未檢出，可能存在其他耐藥機制，如外排泵、生物膜作用[13-15]。

ERIC-PCR是以腸桿菌科基因間重復序列為引物進行 PCR，擴增出多態性的DNA圖譜。它快速、經濟、簡便、重復性較好，其分辨率與脈沖場凝膠電泳(PFGE)高度一致[16]。本研究中的22株耐復方新諾明嗜麥芽窄食單胞菌分型較廣，不存在院內暴發流行。

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